Диссертация (1145736), страница 17
Текст из файла (страница 17)
в экзоне 9 гена sbr(Аванесян, 2009; Ginanova et al. 2016). Делеция не сдвигает рамку считывания, а лишьукорачивает белок на 10 ак. Более того, самцы sbr12/Dp(1;Y) y+ v+ характеризуютсянарушениями сперматогенеза (см. раздел 1.2.5). Самцы генотипа FM6v, y sc8 dm B/Dp(1;Y) y+ v+получены в том же скрещивании, что и мутантные самцы, но характеризуются двумянормальными аллелями гена sbr.Рисунок 27.
Доменная структура белка SBR (в соответствии с Conserved Domain Database(CDD), NCBI12). Домены обозначены так же как на рис.7. Сигнал ядерной локализации (NLS)выделен жёлтым (по Zhang et al. 2011). Зачёркнутые аминокислоты, по-видимому, отсутствуютв коротком семенниково-специфичном белке SBR – “SBR-t” (его длина 536 ак.). Подчёркнутыеаминокислотные последовательности N- и C-концов были использованы для полученияантител. Делеция 10 ак в аллеле sbr12 (TIFITNATHE) выделена красным шрифтом (по Ginanovaet al. 2016).В результате проведённого анализа было показано, что известная универсальнаяизоформа белка SBR имеет молекулярную массу 74 кДа (расчётная масса 76 кДа), она былаобнаружена во всех исследованных тканях D.melanogaster (Рис.
28). Помимо этого, средибелков, выделенных из семенников самцов разных генотипов, наряду с универсальным белкомприсутствует более короткая форма – около 60 кДа (Рис. 28, дорожки 4, 5). По молекулярноймассе она соответствует белку, кодируемому теми транскриптами, которые специфичны длясеменников и синтезируются с альтернативного промотора в интроне 3 (расчётная масса60 кДа).
Такой белок мы далее будем называть SBR-t от «testes» – семенники. Более того, у12http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd74мутантных самцов sbr12/Dp(1;Y) y+ v+, гетерозиготных по делеции sbr12 и аллелю sbr+, белокSBR представлен двумя фракциями – нормальными (SBR, SBR-t) и укороченными в результатеделеции (SBR12, SBR12-t) (Рис.
28, дорожка 4). Таким образом, полученные нами антителаспецифичны в отношении белка SBR, потому что у мутантных самцов выявляют какнормальные белки, так и белки с делецией. Присутствие делеции sbr12 в той части белка,которая использовалась при получении антител (Рис. 27), не препятствует идентификациибелка с делецией. Антитела позволяют выявить новую специфичную для семенников изоформуSBR массой 60 кДа (Ginanova et al.
2016).Рисунок 28. Вестерн-блот анализ белков, выделенных из разных органов имаго D. melanogaster,несущих различные аллели гена sbr. Стрелка указывает на универсальный белок SBR,треугольник – на короткий семенниково-специфичный белок SBR-t. Двойная полосканаблюдается в образце из семенников гетерозиготных самцов-носителей аллеля sbr12. 1 –яичники самок линии дикого типа Oregon-R; 2 – головы самцов sbr12 / Dp(1;Y) y+ v+; 3 – головысамцовFM6v, y sc8 dm B / Dp(1;Y) y+ v+(безделецииsbr12);4–семенникисамцовsbr12 / Dp(1;Y) y+ v+; 5 – семенники самцов FM6v, y sc8 dm B / Dp(1;Y) y+ v+ (без делеции sbr12)(Касаткина, 2007; Ginanova et al. 2016).3.10 Идентификация белка SBR, кодируемого интрон-содержащимитранскриптамиНаибольший интерес для нас представляли самые длинные транскрипты гена sbr,сохраняющие интрон 5.
В начале этого интрона присутствует стоп-кодон, что позволяеттранслировать с последовательности интрона лишь 5 аминокислот. Случаи сохранениягомологичного интрона описаны для разных представителей таксономической группыOpisthokonta (Заднежгутиковые), поскольку в базах данных (FlyBase, GenBank, UCSC Genome)есть сведения об ESTs, включающих части последовательностей интрона и смежного экзона(Мамон и др. 2013). Т.е. сохранение данного интрона эволюционно консервативно для геновNxf1. Помимо этого, сама последовательность интрона консервативна среди представителей75более мелких таксономических рангов – подтип Позвоночные, семейство Drosophilidae, типНематоды, и в каждом случае имеет свои особенности.
Например, у всех позвоночных стопкодон в интроне располагается не спустя 5 кодонов от начала интрона, а через 17, причём эти17 ак практически идентичны у разных животных (Рис. 13) (Mamon et al. 2013; Mamon et al.2014).Короткий белок NXF1, транслируемый с интрон-содержащего транскрипта, уже былидентифицирован другой группой в культуре клеток человека HEK293T (Li et al. 2006) и тканяхмыши (Li et al.
2016). Поэтому было необходимо установить, присутствует ли в тканяхдрозофилы аналогичный короткий белок, соответствующий интрон-содержащему транскриптугена sbr. Для белков млекопитающих упомянутые выше исследователи получили антитела кконсервативному уникальному пептиду длиной 17 ак, кодируемому интроном (Рис. 13).3.10.1Характеристика двух типов антител к пептидам,соответствующим последовательностям экзона 1В случае дрозофилы для получения антител и идентификации короткого белка, которыйсоответствует интрон-содержащему транскрипту гена sbr, невозможно было использоватьпоследовательность, кодируемую интроном из-за ее малой длины (5 ак) и не уникальностисреди всех белков дрозофилы.
Поэтому мы подобрали два олигопептида на N-конце белка SBRтаким образом, чтобы их последовательности были уникальными для белков дрозофилы, такжене встречались среди белков Oryctolagus cuniculus (мы собирались иммунизировать кролика иполучать поликлональные антитела), чтобы пептиды были максимально иммуногенны, несодержали вторичных структур и были гидрофильны. Таким образом, были искусственносинтезированыпептиды,соответствующиеаминокислотам42-56белкаSBR(DRNKRRVSFKPSQCL – пептид №1) и аминокислотам 65-79 (RPEDLRRWDEDDDMS –пептид №2) (Рис. 29), конъюгированы с катионизированным БСА (бычий сывороточныйальбумин), каждым из конъюгатов иммунизировали по одному кролику.
После несколькихраундов очистки и концентрирования мы получили препараты антител, подходящие дляприменения в вестерн-блоте и для иммуногистохимического окрашивания препаратов.Антителаизсывороткикролика,иммунизированногопептидом №2-БСА,оказалисьнизкоконцентрироавнными и недостаточно аффинными; все приведённые ниже данныеполучены с использованием антител из сыворотки кролика, иммунизированного пептидом №1БСА.76Рисунок 29.
Расположение пептидов 1 и 2 в белке SBR, выбранных для выработки антител.Для того чтобы доказать способность антител связываться не только с пептидом (чтобыло показано в иммуноферментном анализе), но и белком SBR, нами были экспрессированырекомбинантные белки recSBR и recSBR-ir в E. coli. Расчётные молекулярные массы такихбелков – 76 и 38 кДа, соответственно. На вестерн-блоте мы видим связывание антител сбелками похожей молекулярной массы, которые соответствуют белкам, чей синтез былиндуцирован в бактериальной культуре запуском Т7 промотора на введённой ранее плазмиде(Рис.
30).Рисунок 30. Проверка антител на рекомбинантных белках дрозофилы, синтезированных вE. coli: recSBR и recSBR-ir. А – Демонстрация индукции синтеза рекомбинантных белков сплазмиды в E. coli, ПААГ-электрофореграмма, окрашенная Coomassie; Б – демонстрацияравной нагрузки образцов после переноса белков на нитроцеллюлозную мембрану, окраскаPonceau S; В – демонстрация связывания антител с белками recSBR и recSBR-ir.1 – лизат бактериальной культуры, трансформированной плазмидой со вставкой кодирующейобласти recSBR до индукции плазмидного промотора; 2 – после индукции; 3 – лизатбактериальной культуры, трансформированной плазмидой со вставкой кодирующей областиrecSBR-ir до индукции плазмидного промотора; 4 – после индукции.77Второй проверкой специфичности связывания антител с белками дрозофилы сталиэксперименты с отменой связывания.
Для этого антитела, выработанные на пептид №1-БСА,инкубировали при +37 °С в течение 20 минут без каких-либо добавок или в присутствии: 5 мкгпептида №1; 5 мкг конъюгата пептид №1-БСА (рассчитано по пептиду); 10 мкг БСА. Послеинкубации был проведён вестерн-блот анализ по стандартному протоколу. Результаты анализа(Рис. 31) говорят о том, что инкубация антител с пептидом №1 или с конъюгатом пептид №1БСА полностью блокирует последующее связывание антител с белками дрозофилы, чего непроисходит в случае инкубации с БСА.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
