Диссертация (1145736), страница 21
Текст из файла (страница 21)
Сохранение гомологичного интрона показано для геновNxf1многихвидовпозвоночных,нематод,дрозофил,укоторыхбылпроведёнтранскриптомный анализ, т.е. является эволюционно консервативным событием (Мамон и др.2013). Поскольку в начале сохранённого интрона находится стоп-кодон, трансляция в этомместе прерывается и образуется белок NXF1, который почти в 2 раза короче универсального.Функции короткого белка неизвестны, но исходя из последовательности транскрипта, егокодирующего, у белка полностью отсутствуют домены NTF2-like и UBA для связи с Nxt1 инуклеопоринами. Впервые короткий NXF1 был обнаружен в группе под руководством MarieLouise Hammarskjold в 2006 году в культуре клеток человека (Li et al.
2006). Во времянаписания автором главы «Обсуждение» та же группа опубликовала статью, в которойаналогичный короткий белок – sNxf1 (small Nxf1), транслируемый с интрон-сохраняющеготранскрипта, был выявлен in vivo у мыши, а также раскрыты интересные функциональныеособенности этого белка (Li et al. 2016).sNxf1 идентифицирован в нескольких тканях мыши, включая мозг. В мозге sNxf1преимущественно сосредоточен в гиппокампе и неокортексе. В отдельных нейронахнеокортекса белок детектируется в виде цитоплазматических гранул, а также присутствует вотростках нейронов. Самое важное открытие заключается в том, что sNxf1 образуетгетеродимер с универсальным белком Nxf1, чем значительно усиливает его способность какимто образом повышать интенсивность трансляции CTE- или Nxf1 CTE-содержащей мРНК вцитоплазме (Li et al.
2016).НапримерегеновNxf1мывидимкрасивейшуюреализациюмеханизматканеспецифичной обратной связи: полноразмерный белок NXF1 экспортирует мРНК гена Nxf1с сохранённым интроном за счёт того, что в интроне содержится последовательность, оченьпохожая на ретровирусный CTE – единственную последовательность, с которой NXF1связывается напрямую, а не через адаптерные белки. С интрон-содержащей мРНКтранслируется короткий белок sNxf1, неспособный самостоятельно осуществлять экспортмРНК, но имеющий сигнал ядерной локализации, чтобы оказаться в ядре, стать кофакторомбелка NXF1, благодаря которому он появился, и многократно усилить продукцию белка sNxf1.В нашей группе незадолго до выхода описанной статьи Li et al.
была опубликованаработа, в которой продемонстрирована роль белка SBR в развитии и функционированиинервной системы дрозофилы (Yakimova et al. 2016). Иммуногистохимическое окрашивание91антителами к С-концу SBR нервного ганглия личинок дрозофилы разного возраста позволиловыявить как общую локализацию белка в отростках нервных клеток (Рис. 8А), так и с бóльшимразрешением посмотреть на гранулы в отростках, содержащие SBR. Сравнив распределениеSBR в гранулах с распределением другого РНК-связывающего белка, dFMR1, мы увидели, чтоколичество гранул, содержащих белок SBR, сравнимо с количеством гранул, содержащих белокdFMR1, однако белки не всегда солокализуются (Рис. 39) (Yakimova et al.
2016). FMRPчеловека участвует в росте отростков нервных клеток и формировании синаптическихконтактов (Jin et al. 2004). В отростках нервных клеток есть гранулы, которые содержат обабелка, только белок dFMR1 или только белок SBR, что предполагает, наличие как общих сdFMR1 мРНК-партнеров белка SBR, так и специфичных (Yakimova et al. 2016).Рисунок 39.
Частичное перекрывание гранул, содержащих белки SBR и dFMR1, в отросткахнейронов личинки первого возраста D. melanogaster. А – Ядра клеток, окраска DAPI; В – SBR,окраска антителами к С-концу SBR; С - dFMR1; D – белок ELAV (маркер нейронов); E –совмещение изображений; масштаб 10 мкм. На нижней панели представлены соответствующиеувеличенные изображения. Стрелками отмечены гранулы, содержащие SBR, треугольниками –гранулы с dFMR1; масштаб 1 мкм (Yakimova et al. 2016).В случае с нейронами мы уверены в том, что антитела к С-концу SBR распознают толькополноразмерный белок SBR D. melanogaster, поскольку нейроспецифичный вариант SBR-ir несодержит С-терминальных доменов.
Следовательно, у дрозофилы цитоплазматическуюлокализацию в нервной ткани проявляет именно белок SBR, у которого есть С-терминальные92домены, возможно, в комплексе с SBR-ir. Последующий иммуногистохимический анализголовного нервного ганглия дрозофилы с помощью антител к N- и С-терминальным концамбелка SBR позволит локализовать области, обогащённые коротким белком SBR-ir и сравнить ихс распределением sNxf1 мыши, описанным американскими коллегами.В вестерн-блот анализе с антителами к N-концу SBR белок SBR-ir присутствовует вобразцах, выделенных из тканей головы и яичника дрозофил, причём больше всего белка былов яичниках, а соответствующий транскрипт длиной 5,1 т.н.
с сохранённым интроном 5представлен в первую очередь в головах взрослых дрозофил и намного меньше в других тканях(Ivankova et al. 2010). Такое несоответствие между количеством транскрипта и белка говорит осложной тканеспецифичной регуляции, позволяющей получить нужное количество белка там,где это необходимо.
Поиску ответа на вопрос о значении обогащения яичника белком SBR-irбудут посвящены дальнейшие исследования.Немаловажным оказывается наблюдение, что при сперматогенезе, в нервной системе ипри раннем эмбриональном развитии обнаружено много так называемых локализованныхмРНК, т.е. мРНК, которые находятся в определённом районе клетки и функционируют толькотам (Iguchi et al, 2006). Локализация мРНК необходима для реализации несколькихбиологических функций: обеспечения высокого уровня продукции белка в месте локализации,предотвращения продукции белка в других областях клетки, организации условий для сборкикаких-либо комплексов в определённом компартменте клетки (Lipshitz and Smibert, 2000).Поэтому как для семенников мы предполагаем участие специфичной изоформы SBR-t вбиогенезе определённых мРНК, необходимых для заключительных стадий формированиясперматозоидов, так и для нервной системы функции короткого белка SBR-ir, скорее всего,связаны с запасанием, хранением и транспортом по отросткам нейронов временнонетранслируемых мРНК.93ЗаключениеВ эволюции усложнение организации особей шло не столько по пути увеличения числагенов, сколько по пути повышения многообразия их продуктов.
Это позволило одному и томуже гену производить продукты как с универсальной, так и специализированными функциями.Гены Nxf1 являются эволюционно древними. Гомолог Nxf1 у дрожжей, MEX67, появляется вэволюции одновременно с образованием ядерной мембраны для обеспечения экспорта мРНК изядра в цитоплазму (Segref et al. 1997).Гены семейства Nxf объединяет сходство доменной структуры белковых продуктов сбелком NXF1 (Herold et al. 2000).
Формирование семейства генов Nxf происходило в результатеразличных механизмов, таких как дупликация гена за счет хромосомных перестроек илинеравногокроссинговераспоследующейдивергенциейегокопиииликопий.Специализированные функции генов семейства Nxf не всегда известны. Преимущественнаяцитоплазматическая локализация белков, кодируемых генами-паралогами Nxf1, дала основаниепредполагать, что специализация этих генов в пределах генного семейства шла по путиограничениякругамРНКтеми,которыеотносятсякклассудолгоживущихиорганоспецифичных. Паралоги гена Nxf1 млекопитающих экспрессируются преимущественно втканях мозга, или мозга и семенников, т.е.
как раз там, где существенную роль в регуляцииэкспрессии генов играет пост-транскрипционная регуляция (Jun et al. 2001; Sasaki et al. 2005;Tan et al. 2005; Tretyakova et al. 2005; Katahira et al. 2008).У D.melanogaster ген sbr (Dm nxf1) является наиболее изученным в семействе Nxf.Функции генов-паралогов семейства Nxf у дрозофилы остаются не известными (Herold et al.2001). Для гена sbr описаны транскрипты, которые преимущественно присутствуют в тканяхсеменников, или тканях головы взрослых особей дрозофилы, есть и такие, которые встречаютсятолько в яичниках (Ivankova et al. 2010).
В данной работе была проверена гипотеза оспециализированных функциях, присущих нейро-специфичным и семенниково-специфичнымтранскриптам sbr, которая привела к идентификации двух укороченных изоформ белка SBR:SBR-t и SBR-ir. Доменная организация укороченных белковых форм, а также показанная ранеецитоплазматическая локализация, присущая белкам SBR дрозофилы в разных тканях(Ацапкина и др.
2010; Голубкова и др. 2015; Yakimova et al. 2016), позволяют сформулироватьпредположение о том, что функции белка SBR и/или его органоспецифичных изоформзаключаются в сохранении связи с РНП комплексами после их экспорта из ядра. Поискспециализированных мРНК-мишеней, которые в цитоплазме находятся в составе РНП частиц сSBR, позволит объяснить природу дефектов, наблюдаемых у мутантов по гену sbr, и понятьэволюционные механизмы специализации белков семейства NXF.94Выводы1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
