Диссертация (1145736), страница 20
Текст из файла (страница 20)
Трансляция основной рамкисчитывания замедляется из-за того, что рибосомы в первую очередь инициируют синтез накоротких uORF перед ней (Medenbach et al. 2011). Наличие интрона в 5'UTR – также один изспособов контроля метаболизма транскрипта. Такой особенностью обычно обладаютрегуляторные мРНК. Отсутствие длинной 5'UTR для посадки транскрипционных факторов иблизость EJC к 5’-концу транскрипта положительно влияют на динамику экспорта и86трансляции мРНК (Bicknell et al. 2012). В семенниках дрозофилы обнаружены транскрипты сTSS в интроне 3 обоих типов: и с шестью uORF для замедления трансляции и с интроном в5'UTR для её ускорения. Возможно, эти транскрипты функционируют на разных стадияхсперматогенеза – процесса, для которого характерна чёткая временная регуляция транскрипциии трансляции.Любой из двух типов выявленных нами семенниковых транскриптов способенкодировать один и тот же белок, поскольку старт-кодон находится в начале экзона 4 (Рис.
35).При старте трансляции в этом месте образуется укороченный семенниково-специфичный белокSBR, который мы называем SBR-t. Ранее ни для одного из генов Nxf1 животных не былоописано подобного белка. В SBR-t по сравнению с SBR отсутствует N-терминальная частьбелка. N-терминальная последовательность SBR содержит сигнал ядерной локализации (NLS)(Zhang et al. 2011). Отсутствие NLS в SBR-t может ограничивать транспорт этого белка в ядро.Также SBR-t утрачивает часть РНК-связывающего домена (RBD) (Рис.
27, зачёркнутаяпоследовательность). Таким образом, короткий белок не способен выполнять функцию,характернуюдляполноразмерногобелкаSBR,искореевсего,ограничиваетсяспециализированными функциями вне ядра.4.2Роль белков SBR в сперматогенезе4.2.1 SBR-t – изоформа белка SBR, специфичная для семенниковУтрата NLS лишает белок SBR-t права называться транспортным рецептором мРНК, ноне лишает возможности принимать участие в экспорте мРНК, как это, например, делает белокчеловека NXF3, который содержит сигналы ядерного экспорта для выхода из ядра в доменахLRR, NTF2-like и UBA (Yang et al.
2001; Thakurta et al. 2004; Kang and Cullen, 1999). Вместе сNLS SBR-t утрачивает также предполагаемый участок олигомеризации с белком NXF1(предполагаемый – потому что олигомеризация не доказана для дрозофилы; в случае NXF1человека это аминокислоты 1-61) (Matzat et al. 2008). Так или иначе, можно предположить, чтодля белка SBR-t возможна цитоплазматическая локализация.При проведённом ранее иммуногистохимическом окрашивании семенников дрозофилыантителами, видно, что белок распределён не только в ядре, но в виде гранул в цитоплазмепервичных сперматоцитов (Рис. 8Б), а также на стадии округлых сперматид после завершениявторого деления мейоза (Ацапкина и др. 2010). К сожалению, антитела к C-концу белка SBR непозволяют различить белки SBR и SBR-t, аминокислотные последовательности которыхполностью совпадают, поэтому невозможно сказать, какой из белков демонстрируетцитоплазматическую локализацию.
Однако, поскольку в культурах клеток дрозофилы белокSBR всегда сосредоточен в ядре (Herold et al. 2001; Kopytova et al. 2016), можно заключить, что87в ядре присутствует универсальный белок, а в цитоплазме клеток семенников – SBR-t. Политературным данным похожую картину можно наблюдать при экспрессии белка SBR,лишённого сигнала ядерной локализации (Δ1-136 ак) и конъюгированного с HA-tag (humaninfluenza hemagglutinin), в культуре эмбриональных клеток дрозофилы SL2: сигналсосредоточен на ядерной оболочке и в цитоплазме в виде гранул (Рис. 36) (Herold et al. 2001).Цитоплазматическая локализация также характерна для других семенниково-специфичныхбелков семейства NXF млекопитающих (Herold et al. 2000; Sasaki et al.
2005; Tan et al. 2005).Рисунок 36. Клетки SL2, трансфицированные плазмидами для экспрессии гибридных белковNXF1-HA и укороченного с N-конца NXF1(137-672)-HA. Белки с HA-tag визуализированыметодом непрямой иммунофлуоресценции (левая панель), ядра клеток маркированыантителами к эндогенному ядерному белку Dm REF1 (правая панель) (Herold et al. 2001).4.2.2 Делеция sbr12, затрагивающая домен NTF2-like белка SBR, приводит кстерильности самцов D.
melanogasterКакую же функцию выполняют белки SBR и SBR-t в сперматогенезе? В этой работе,пытаясь подтвердить специфичность связывания антител к C-концу белка SBR в вестерн-блоте,мы взяли в анализ стерильных самцов с мутантным делеционным аллелем sbr12, получив, такимобразом, дополнительную возможность изучить молекулярные механизмы сперматогенеза.Делеция sbr12, затрагивающая домен NTF2-like (Рис. 27, делеция выделена красным шрифтом),приводит к нарушениям сперматогенеза.
Самцы, гетерозиготные по аллелю sbr12, стерильны ине содержат в семенниках подвижных сперматозоидов (Касаткина, 2007; Голубкова и др. 2015).Эти нарушения аллель-специфичны и доминантны, т.е. нормальный белок, присутствуя нарядус мутантным, не способен обеспечить формирование функциональных сперматозоидов.Действительно, на рисунке 28 можно видеть, что у самцов генотипа sbr12/Dp(1;Y) y+ v+88присутствуют как нормальные белки SBR и SBR-t, так и их укороченные в результате делециина 10 аминокислот варианты. Встает вопрос, почему домен NTF2-like так важен для завершениясперматогенеза.Белки NXF1 осуществляют экспорт мРНК только в комплексе с кофактором Nxt1(Fribourg et al. 2001). Для связывания NXF1 человека с Nxt1 необходим домен NTF2-like(Suyama et al. 2000), а именно последние 33 его аминокислоты (Guzik et al.
2001). Делеция sbr12у дрозофилы удаляет последние 6 ак домена NTF2-like (Ginanova et al. 2016). Моделированиевторичной структуры нормального белка SBR и мутантного белка SBR12 показывает измененияв районе делеции: утрату одной альфа-спирали при отсутствии изменений в других частяхбелка (Рис. 37) (использовано приложение PredictProtein15, Yachdav et al. 2014).Рисунок 37. Результат моделирования вторичной структуры белков SBR и SBR12. Альфаспирали обозачены красным цветом, бета-складки синим.Следует отметить, что при дефекте Nxt1 многие семенниково-специфичные транскриптыгенов, экспрессирующихся в семенниках, не накапливаются (Caporilli et al.
2013). Поэтому мыпредполагаем, что делеция sbr12 может влиять на структуру димера NXF1-Nxt1, изменяя егосродство к мРНК-мишеням (Ginanova et al. 2016).Важной особенностью сперматогенеза является сохранение различных транскриптов вовременно недоступном для трансляции состоянии (Schäfer et al. 1995). Этап формированиязрелого подвижного сперматозоида, называемый спермиогенезом, протекает в отсутствиитранскрипции, за счёт трансляции мРНК, синтез которых происходит в профазе мейоза настадии первичных сперматоцитов (Olivieri and Olivieri, 1965) или на стадии сперматид (синтезограниченного набора мРНК) (Barreau et al. 2008, Vibranovski et al.
2009, 2010). Такие мРНКдолжны быть временно защищены от трансляции, находясь в составе комплексов РНП. Частьзапасённых мРНК в дальнейшем используются для замены гистонов на протамины в ядреспермия (Rathke et al. 2007) и для построения аксонемы из базального тельца, котороеприкрепляется к ядерной мембране (Wei et al. 2008).
Вокруг базального тельца,ассоциированного с ядром, собираются митохондрии, которые затем преобразуются вмитохондриальные производные – Небенкерн (Aldridge et al. 2007; Fabian and Brill, 2012). Усамцов с аллелем sbr12 на стадии удлинения сперматид самыми частыми нарушениямиявляются дефекты аксонемы и митохондриального производного (Рис. 9) (Голубкова и др.15https://www.predictprotein.org/892015). И аксонема, и митохондриальные производные связаны с ядром, поэтому ядернаяоболочка может служить компартментом для локализации временно нетранслируемых мРНК,необходимых для спермиогенеза.
Проследив за локализацией белка SBR на стадиииндивидуализации сперматид (используя антитела к С-терминальному фрагменту), что былосделано ранее, можно обратить внимание на то, что белок SBR локализуется на выпуклойстороне ядра (Рис. 38) (Ацапкина и др. 2010). Там же в ходе перестройки ядерной мембранысосредотачиваются ядерные поровые комплексы (Fuller, 1993).Рисунок 38. Сперматиды на этапе элонгации. Белок SBR перемещается на одну сторонуформирующейся головки спермия. Окраска антителами к С-концу SBR, вторичные антителамечены Alexa Fluor 546, окраска ядер DAPI (Ацапкина и др.
2010).Затем белок SBR покидает ядерную оболочку и в виде гранул перемещается в хвостсперматозоида (Ацапкина и др. 2010). Комплекс индивидуализации осуществляет перемещениекомпонентов цитоплазмы к дистальному концу сперматид и обеспечивает каждую клеткуцисты самостоятельной мембраной (Fabrizio et al. 1998; Noguchi and Miller, 2003). Его движениесопровождается активной протеасомной деградацией белков (Zhong and Belote, 2007), в томчисле и тех, которые сохраняют временно нетранслируемые мРНК, важные для формированияфункционального сперматозоида. Гранулы, содержащие SBR, видны только в ближайшей кядру половине хвоста сперматозоида (Atsapkina et al. 2010), что предполагает его деградацию,поскольку его накопления на дистальном конце удлинённых сперматид не происходит.Спермиогенез протекает в отсутствие транскрипции мРНК, значит, экспортная функция sbr наданном этапе также не нужна.
Таким образом, можно предположить, что специализированнаясеменниково-специфичная функция гена sbr заключается в обеспечении биогенеза мРНК,важных для формирования подвижного сперматозоида. Вероятно, именно эту функциюреализует белок SBR-t, который сохраняет все необходимые для связывания с РНК домены, ноутрачивает сигнал ядерной локализации (Ginanova et al. 2016). Дальнейшие исследованияпозволят ответить на вопрос о том, какие мРНК являются мишенями белков SBR.904.3Белки SBR в функционировании нервной системы дрозофилыЕщё одним впервые выявленным белком NXF1 стал белок SBR-ir, который в даннойработе был обозначен как сокращение от «intron retention – сохранение интрона», посколькуматрицей для синтеза этого белка является длинный транскрипт, в котором невырезаннымостаётся один из интронов – интрон 5.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
