Диссертация (1145681), страница 21
Текст из файла (страница 21)
он взаимодействует со своими мишенями через другиетранскрипционные факторы, модулируя их активность (Fingerman et al., 2003,Cipollina et al., 2008). К тому же, консенсусы Sfp1-связывающих мотивов являются121последовательности, с которыми связываются другие транскрипционные факторы(см. Cipollina et al., 2008), а единственный известный сайт, уникальный для Sfp1отсутствует в промоторах большинства мишеней Sfp1 (Zhu et al., 2009). Такимобразом точные функции цинковых пальцев Sfp1 остаются неизвестными.Как ни странно, вариант Sfp1, лишённый C-терминального цинкового пальца,оказался способен усиливать транскрипцию SUP35 и SUP45.
Но наблюдаемые приэтом эффекты довольно слабые, т.к. мы не обнаружили разницы в уровнях белковSup35 или Sup45 при сверхпродукции Sfp1 C. Мутация в C-терминальномцинковомпальцеприводилакнарушениюспособностиSfp1усиливатьтранскрипцию генов риосомных белков (Fingerman et al., 2003) и к нарушениюядерной локализации Sfp1, вероятно, из-за дефекта во взаимодействии с Mrs6(Lempiainen et al., 2009). Однако мы показали, что сверхпродукция Sfp1 C остаётсячастично функциональной, т.к.
проявляется в аллосупрессии [PSI+] и в усилениисинтетической летальности, что свидетельствует в пользу небольшого усиленияпродукции Sup35, которое нам не удалось зарегистрировать. Действительно,эффектыдополнительнойсверхэкспрессииSFP1илиэкспрессииSFP1-fs636.SUP35Такимнапоминалиобразом,эффектыделеция3-го(С-терминального) цинкового пальца по-видимому неполностью инактивирует Sfp1.Дальнейшее изучение роли цинковых пальцев в различных свойствах Sfp1 помогутлучше разобраться в том, какую функцию выполняют эти домены.Ранее был описан антисупрессорный эффект при сверхэкспрессии SFP1I нафоне некоторых мутаций sup35 и sup45 (Rogoza et al., 2010; Drozdova et al., 2013).
Вчастности, было показано, что сверхэкспрессия SFP1 индуцирует [ISP+], которыйпроявляется в виде антисупрессии в штамме определёнными комбинациями мутацийsup35 и sup45 (Aksenova et al. 2006; Rogoza et al. 2010). В данной работе мы показалиусиление синтетической летальности, и слабую аллосупрессию [PSI+] присверхэкспрессииSFP1иSFP1-fs636,соответственно.Ранеескринингаллосупрессоров не выявил супрессорных свойств SFP1-fs636 (Нижников и др., 2011;122Нижников и др., 2013). Однако отсутствие результата может быть следствиемразличий в использованных тест-системах.
Мы далее обнаружили, что присверхэкспрессииSFP1происходитувеличениеуровнямРНКSUP35исоответствующего белка, что может объяснить усиление синтетической летальностии прионной токсичности. Мы также проверили уровень экспрессии SUP45.Сверхэкспрессия SFP1 приводила к примерно одинаковому увеличению уровнямРНК SUP35 и SUP45 (приблизителльно в 1,5 раза), но различия в уровне белковудалось достоверно показать только для Sup35. Неясно с чем связаны эти различия,но возможно ни вызваны тем, что мы оценивали уровни мРНК при сверхэкспрессииSFP1-fs636, т.к. нам не удалось сделать это при сверхэкспрессии аллели SFP1 дикоготипа, вероятно из-за сильного ингибирования роста клеток. Дополнительнаяэкспрессия SUP45 (как дикого типа, так и мутантного) приводила к снижениюсинтетической летальности (Kiktev et al. 2007 и Рис.
23). Несмотря на повышеннуюэкспрессию SUP45, мы наблюдали противоположный эффект в тест-системе присверхэкспрессии SFP1. Таким образом, либо уровень белка Sup45 всё-таки неменяется, либо его увеличения недостаточно для того, чтобы оказать заметноеослаблениесинтетическойлетальности.Значит,основнымпоследствиемсверхпродукции Sfp1 является увеличение уровня Sup35, которое может приводить кнебольшой аллосупрессии [PSI+] и к прионной токсичности.Феномен прионной токсичности [PSI+] ещё до открытия прионной природыфактора [PSI+] (Dagkesamanskaya and Ter-Avanesyan 1991; Chernoff et al. 1992).Неспособностьштамма[PRION+]нормальнорастиприсверхпродукциисоответствующего прионного белка не уникально для [PSI+]; сверхпродукция Rnq1также токсична для штаммов [PIN+] (Douglas et al. 2008), что наводит на мысль осуществовании общих меанизмов у этих процессов.
Хотя точные механизмыостаются неизвестными, очевидно, что в механизм токсичности [PSI+] вовлечёнSup45 (Derkatch et al. 1998). Ко-сверхэкспрессия SUP45 компенсирует токсичность,вызванную сверхэкспрессией SUP35, но не SUP35NM (Vishveshwara et al. 2009), что123говорит о том, что во втором случае другие факторы могут определять токсичность.Однако мы показали, что токсичность SUP35NM тоже может быть частичнокомпенсирована сверхэкспрессией SUP45, что говорит о том, что компенсация можетзависеть от балланса уровней Sup35NM и Sup45. Однако, летальность, вызваннаяконститутивной сверхэкспрессией SFP1, не компенсируется сверхэкспрессией SUP45,подкрепляя идею о том, что другие факторы могут играть существенную роль вмеханизме [PSI+]-зависимой летальности.
Наша попытка идентифицировать этифакторы привела к открытию того факта, что Sis1 способен облегчать токсичность[PSI+], вызванную сверхэкспрессией как Sfp1, так и Sup35. В отличие от HSP104 иSUP35C, которые также избавляли клетки от летального эффекта, SIS1 не изгонял инемаскировалфенотип[PSI+],чтоявляетсяаргументомвпользуегонепосредственного участия в контроле токсичности прионных агрегатов.Известно, что сверхэкспрессия SIS1 компенсирует токсичность хантингтина(polyQ) в дрожжах (Gokhale et al., 2005), а также токсичность [PIN+]/[RNQ+] (Douglaset al.
2008), и токсичность, вызванную сверхпродукцией Q/N-богатого домена белкаPin4C в присутствии [PIN+] (Yang et al., 2014). Мы показали, что токсичность [PSI+] иSfp1/[PSI+] также компенсируется высоким уровнем экспрессии SIS1. Таким образом,наблюдаемые нами эффекты могут быть проявлением общей функции Sis1, какингибитора токсичности амилоидных агрегатов. Можно предложить нескольковозможных механизмов, как Sis1 противодействует токсичным эффектам экспрессииSFP1 или SUP35:1.
Избыток Sis1 может способствать разрезанию агрегатов комплексомHsp40/Hsp70/Hsp104, приводя к более эффективной дезинтеграции крупныхтоксичных агрегатов, превращая их в небольшие олигомеры, в которых Sup35остаётся частично функционален.2. При сверхпродукции Sis1 предпочтительно транспортируется к агрегатам иблокирует связывание других жизненно-важных белков с агрегатами, предотвращаявозникновение прионной токсичности.1243. Сам Sis1 является жизненно-важным белком и его титрование на агрегатыи, соответственно, уход из цитозоли, также могут быть причиной прион-зависимойтоксичности, а потому дополнительная продукция Sis1 восстанавливает уровеньцитоплазматическогоSis1,необходимыйдляподдержаниянормальнойжизнедеятельности клетки. Сложно отдать предпочтение какой-либо из гипотез, таккак единый механизм прионной токсичности до сих пор не известен.Молекулы Sup35 в амилоидной форме не теряют значительную часть своейферментативной активности, что позволяет небольшим олигомерам оставатьсяфункциональными.
Увеличение среднего размера прионных агрегатов может снизитьих функциональность, в результате чего, уровень оставшегося активным белка можетоказаться слишком мал для выживания клетки (Pezza et al. 2014). Мы показали, чтоиндуцированная экспрессия SFP1 приводит к увеличению размера агрегатов Sup35, иэто увеличение исчезает при коэкспрессии SIS1. На этом может быть основан ещёодин механизм прионной токсичности Sfp1/[PSI+]. Мы обнаружили, что Sfp1способен формировать SDS-устойчивые агрегаты in vivo, но Sis1 не влияет на ихразмер. Это наблюдение позволяет предположить, что сама прионная токсичность несвязана с появлением агрегатов Sfp1. Этому соответствует результаты экспериментовпо колокализации, в которых Sfp1 вовлекался в агрегаты Sup35, но не наоборот.Можно предложить по крайней мере 2 механизма, описывающих, как агрегация Sfp1может приводить к увеличению размера агрегатов Sfp1:1.
Амилоиды Sfp1 могут титровать цитоплазматические факторы, которыевлияют на агрегацию Sup35; Sis1 может являться таким фактором.2. Черезгетерологичныеамилоидныевзаимодействия,Sfp1можетсеквестрироваться агрегатами [PSI+], приводя к их увеличению в размере. В такомслучае Sis1 может возвращать агрегаты Sup35 к прежему размеру либо не давая Sfp1связываться с агрегатами Sup35, либо через общее увеличение дезагрегационнойактивности комплексов шаперонов. Неожиданным результатом является то, чтоконститутивная сверхэкспрессия SFP1 не приводит к изменению размера агрегатов125Sup35, хотя более слабая, индуцируемая экспрессия, приводит. Причины этогонесоответствия остаются неясны, также как неясно, почему не удаётся детектироватьбелок Sfp1 при экспрессии его гена под контролем сильного конститутивногопромотора GPD.
Возможно, эти два явления связаны между собой, но так ли иначе,токсичность Sfp1 в этом случае не может являться следствием увеличения размераагрегатов Sup35. Тем не менее, Sis1 компенсирует токсичность как приконститутивной, так и при индуцированной экспрессии SFP1, что говорит о том, чтовозможно, в не только в проявлении токсичности, но и в её компенсации Sis1задействовано более одного механизма. Дальнейшее изучение вовлечения Sis1 врегуляцию [PSI+]-зависимой летальности должно улучшить наше пониманиемолекулярных механизмов этого феномена, но уже в данной работе мы наблюдали,что для компенсации токсичности [PSI+] необходим интактный C-конец Sis1.Причины подобного явления также требую отдельного изучения.4.5. Действие фактора сортинга шаперонов Cur1 на прионы опосредованоядерным импортом Sis1.Факторы сортинга шаперонов Cur1 и Btn2 были идентифицированы как белки,изгоняющие прион [URE3] (Kryndushkin et al., 2008), а также искусственный прион[NRP1C+] (Malinovska et al., 2012).
Известно, что Cur1 и Btn2 не изгоняют [PSI+](Wickner et al., 2014). С помощью тест-системы мы установили, что оба фактораусиливают синтетическую летальность, но при этом только Cur1, но не Btn2,усиливает фенотип приона [PSI+]. Более того, мы показали, что делеция CUR1ослабляет фенотип [PSI+]S. Оба этих эффекта сильнее проявляются при росте приповышенной температуре, что согласуется с тем фактом, что Cur1 сильнееэкспресируется и более стабилен при повышенных температурах.Антагонистическое влияние на [PSI+] и [URE3] было известно и ранее, преждевсего для шаперонов семейства Hsp70-Ssa. (Schwimmer and Masison, 2002; Roberts etal., 2004; Hung and Masison, 2006; Sharma and Masison, 2008).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
