Диссертация (1145681), страница 17
Текст из файла (страница 17)
33Б). Таким образом, именно увеличение экспрессииCUR1 усиливает нонсенс-супрессорный фенотип [PSI+].АБВГДРисунок 33. CUR1, но не BTN2, усиливает фенотип [PSI+]. А, Б. OT56 и OT55, былитрансформированы pRS426-CUR1 (↑↑CUR1) или pAG416GPD-Btn2 (↑↑BTN2); вектор – pRS426. Б.Фенотип трансформантов анализировали до и после пассирования на среду 5-FOA. Зачёркиваниеобозначает потерю соответствующей плазмиды. В. Представлены штаммы 2-OT56 ([psi–]), OT56-ck([PSI+]S cur1Δ) и OT56 ([PSI+]S CUR1). А, Б, В. Показаны репрезентативные серии 10-кратныхразведений; в скобках указано количество дней инкубации. Г. Штаммы OT56 (CUR1) и OT56-ck(cur1Δ) анализировали в тест-системе при различных температурах.
Д. Серии 10-кратныхразведений различных изолятов OT55, несущих делеции CUR1 или BTN2. Над пунктирной чертой –контрольные штаммы 2-OT56 ([psi–]), OT56 ([PSI+]S) и OT55 ([PSI+]W).95Для оценки влияния нативного уровня CUR1 на свойства приона [PSI+] мысконструировали штаммы на основе OT56 и OT55, в которых хромосомная копиягена CUR1 делетирована путём замещения на ген устойчивости к генетицину(kanMX). Оценка нонсенс-супрессии показала, что на фоне сильного варианта [PSI+]делеция CUR1 приводит небольшому ослаблению супрессии в штамме OT56-ck,более заметному при росте штаммов при 34 °C (Рис.
33В). Сравнение этого штамма сисходным OT56 в тест-системе синтетической летальности показало, что делецияCUR1 едва заметно ослабляет синтетическую летальность, причём различия такжепроявлялись более контрастно при росте при 34 °C (Рис. 33Г). Таким образом можносделать вывод, что даже нативная экспрессия CUR1 усиливает фенотип приона [PSI+].Однако мы не смогли установить, влияет ли делеция CUR1 на фенотип слабоговарианта [PSI+]W, так как различные производные штамма OT55, несущие делециюCUR1 сильно варьировали по силе супрессии, которая у некоторых штаммовоказалась сильнее, а у некоторых слабее, чем у исходного OT55 (Рис. 33Д).3.5.3. Cur1 не влияет на свойства агрегатов [PSI+], на изгнание приона ина его индукциюМы решили определить, каким образом сверхэкспрессия CUR1 влияет насвоства [PSI+].
В первую очередь, мы проверили, влияет ли CUR1 на свойстваамилоидных агрегатов Sup35 в штаммах [PSI+]. SDD-AGE показал отсутствиевлияния CUR1 и BTN2 на распределение агрегатов Sup35 по размеру в штаммахOT56 и OT55 (Рис. 34А). Визуализация агрегатов [PSI+] in vivo методамифлуоресцентной микроскопии с помощью «декорирования» нативных агрегатовкоэкспрессией SUP35NM-GFP и SUP35N-GFP-MC также не позволила обнаружитьразличия между наличием и отсутствием сверхэкспрессии CUR1 (данные непредставлены), однако было отмечено, что в присутствии SUP35NM-GFP иSUP35N-GFP-MC сверхэкспрессия CUR1 приводит к более выраженному усилениюсупрессии [PSI+]W (Рис.
34Б).96Далее мы оценили влияние CUR1 на изгнание приона [PSI+] присверхэкспрессии HSP104. Поскольку слабые варианты [PSI+] изгоняются быстрее,чем сильные варианты (Newnam et al., 1999), мы индуцировали сверхэкспрессиюHSP104 под контролем промотора GAL1,10 в штамме OT55 в течение 4,5 часов, а вштамме OT56 – в течение 12 часов. В обоих случаях сверхэкспрессия CUR1 неповлияла на эффективность изгнания [PSI+] (Рис. 34В).АБВГРисунок 34. CUR1 не влияет на свойства агрегатов [PSI+], на его изгнание и индукцию.
А.SDD-AGE с пробами белков, выделенных из трансформантов OT56 ([PSI+]S), OT55 ([PSI+]W) и2-OT56 ([psi–]) плазмидами pRS426-CUR1 (↑↑CUR1), pAG416GPD-Btn2 (↑↑BTN2) или pRS426(вектор). Б. Серии 5-кратных разведений OT55 ([PSI+]W), трансформированного pRS425-CUR1(↑↑CUR1) или pRS425 вместе с pmCUP-NM-GFP (pCUP1-SUP35NM-GFP), или pUCNGMC(pCUP1-SUP35N-GFP-MC); вектор – pRS316. Для индукции промотора CUP1 в среду добавляли150μM CuSO4. B. OT55 и OT56 были трансформированы pYSGal104 вместе с pRS425-CUR1 илиpRS425. Сверхэкспрессию HSP104 индуцировали, перенесением клеток в среду без глюкозы cраффинозой и галактозой на 4,5 или 12 часов. Для получение контрольных проб без индукцииHSP104, штаммы растили в среде с глюкозой. Фенотип клеток анализировали с помощью серий5-кратных разведений на указанных средах.
Д. Указанные штаммы трансформировали pRS316GAL(вектор), pGAL-GFP (↑GFP), pRS316GAL-SUP35N (↑SUP35N), pRS316GAL-SUP35NM-GFP(↑SUP35NM-GFP), CEN GAL SUP35-RFP (↑SUP35ΔS-DsRed) или CEN GAL SUP35 (↑SUP35)вместе с pRS425-CUR1 или pRS425. Трансформантов растили в среде без глюкозы c раффинозой игалактозой в течение 24 часов, после чего равные количества клеток переносили на селективныесреды для оценки нонсенс-супрессии.97Мы также оценили влияние сверхэкспрессии CUR1 на частоту спонтанноговозникновения [PSI+] de novo, но не обнаружили отличий от контроля (данные непредставлены).
Тогда мы провели эксперимент по индукции [PSI+] сверхэкспрессиейразличных фрагментов гена SUP35 в штаммах 1-OT55 ([psi–][PIN+] производноештамма OT55) и 1-OT56 ([psi–][PIN+] производное штамма OT56). Штаммы[psi–][pin–] использовали в качестве контролей (Рис. 34Г). Для индукции [PSI+] мысверхпродуцировали Sup35N, Sup35NM, Sup35ΔS или полноразмерный Sup35, спомощью конструкций с промотором GAL1,10. Сверхэкспрессия CUR1 не повлиялана возникновение [PSI+] ни в одном из случаев (Рис.
34Г).3.5.4. Делеционный анализ гена CUR1Известно, что в составе белка Cur1 есть функциональная последовательностьсигнала ядерной локализации (NLS) (Malinovska et al., 2012), однако других данныхофункциональнойорганизациибелканет.Дляопределениявозможныхфункциональных доменов белка, мы провели делеционный анализ гена CUR1. Намибыла сконструирована серия плазмид для сверхэкспрессии аллелей CUR1 сразличными делециями, которые затем проверялись на способность усиливатьсинтетическую летальность, усиливать [PSI+] и излечивать [URE3].
Оказалось, чтоделеция N-концевого участка, не затрагивающая NLS (с 3-й по 22-ю а-к), приводит кусилению влияния Cur1 как на синтетическую летальность (Рис. 35А), так и насупрессию в штамме [PSI+], и на изгнание [URE3] (Рис. 35Б). На фоне [PSI+]S,сверхэкспрессия cur1Δ3-22 приводила также к заметному ухудшению роста клонов,более выраженному на фоне делеции хромосомной копии CUR1 (Рис.
35Б). Всеостальные делеции приводили к тому, что эффекты во всех тестах исчезали или, какв случае делеции с 3й по 30ю аминокислоты, включающей и последовательностьNLS, становились заметно слабее (Рис. 35А, Б).98АБРисунок 35. Делеционный анализ гена CUR1. A. Результаты скрещиваний штамма ОТ56, вкотором были сверхэкспрессированы аллели CUR1 c указанными делециями, cо штаммамиL-1A-D1628. Б. Штаммы ОТ520 (BY241), OT55, OT56 и OT56-ck были трансформированыплазмидами для сверхэкспрессии указанных делеционных вариантов CUR1; вектор – pRS426.Слева изображена схема расположения делетированных участков. Трансформантов анализировалис помощью серий пятикратных разведений на селективных средах.3.5.5. Скрининг основных шаперонов клеток дрожжей в тест-системесинтетической летальности и их влияние на прионы [PSI+] и [URE3]Ранее в нашей лаборатории уже было обнаружено влияние некоторыхшаперонов семейств Hsp100 и Hsp70 на синтетическую летальность (Киктев, 2008;Киктев и др., 2011).
Мы проанализировали эти и другие гены, кодирующиеклеточные шапероны в тест-системе синтетической летальности (Рис. 36, Рис. 38).99Рисунок 36. Влияние основных клеточных шаперонов на синтетическую летальность. Слева,результаты скрещиваний штамма ОТ56, трансформированного плазмидами для сверхэкспрессииуказанных генов, c производными штамма 1A-D1628, справа – рост на селективных средах, несодержащих аденин: два верхних ряда – трансформанты плазмидами, маркированными LEU2,скрещивания со штаммами U-1A-D1628; 3-й ряд – трансформанты плазмидами URA3, скрещиваниясо штаммами L-1A-D1628; 4-й ряд – трансформанты плазмидами TRP1, скрещивания со штаммамиU-1A-D1628. Красным шрифтом отмечены гены, сверхэкспрессия которых ослабляетсинтетическую летальность, а зелёным – усиливает.Известно, что сверхэкспрессия как CUR1, так и BTN2, приводит к изгнаниюприона [URE3] (Kryndushkin et al., 2008); кроме того, сверхэкспрессия CUR1приводит к усилению супрессорного фенотипа приона [PSI+].
Поэтому мы такжепроверили влияние сверхпродукции различных шаперонов на поддержание прионов100[PSI+] и [URE3] (Рис. 37А,Б). Штамм OT520, несущий вариант приона [URE3-1], былсконструирован таким образом, что клоны [URE3-1], в отличие от [ure-0],прототрофны по аденину, и возможна красно-белая цветная селекция [URE3]/[ure-0]штаммов. Это позволило количественно оценить частоту потери [URE3] (Рис. 37В) спомощью метода, описанного ранее (Kryndushkin et al., 2008).АБВРисунок 37. Фенотипический анализ влияния основных клеточных шаперонов на прионы[PSI+] и [URE3]. Серии 10-кратных разведений трансформантов OT56 (А) и OT520 (Б) плазмидами,маркированными LEU2, для сверхэкспрессии указанных генов. В скобках снизу указано количестводней инкубации.
Красным шрифтом отмечены гены, сверхэкспрессия которых ослабляетсинтетическую летальность, а зелёным – усиливает. mC – mCherry. В. Количественная оценкачастоты потери приона [URE3] при сверхэкспрессии указанных генов. Планки погрешностейобозначают доверительные интервалы (уровень значимости 0,05). *, p<0,05.Сводные результаты всех этих экспериментов представлены в таблице 8.101Таблица 8. Влияние шаперонов на синтетическую летальность, а также на поддержание ипроявление прионов [PSI+] и [URE3].Сверхэкспрессированный генСинтетическаялетальность[PSI+][URE3]HSP104↓↓↓↓↓↓–SSB1↓↓↓↓?SSB2↓↓↓↓?SSA1↑↑↑–SSA2↑↑–↓SSA3–––SSA4↓↓↓–SIS1↓↓––YDJ1↑↑↑↑↑↓↓↓HSP26↑↑––HSP42↑↑↑↑/–*↓↓↓CUR1↑↑↑↑↑↓↓↓BTN2↑↑–↓↓↓Стрелки вверх/вниз обозначают усиление/ослабление, количество стрелок соответствуетстепени выраженности эффекта; ? – эффект не анализировался.* наблюдалось усиление сильного [PSI+]S, но не слабого варианта [PSI+]W (данные непредставлены).Мы обнаружили, что YDJ1 и HSP42 действуют схожим образом с CUR1 во всехтрёх системах, что позволяет предположить их участие в едином механизме.
Дляпроверки этого предположения, мы решили выяснить, зависит ли влияние на [PSI+]каждого из этих генов от присутствия остальных. Выяснилось, что делеция CUR1 невлияет на усиление [PSI+] при сверхэкспрессии как HSP42, так и YDJ1 (Рис. 38), аделеция HSP42 не препятствует усилению [PSI+], вызванному сверхэкспрессиейCUR1 (Рис. 38). Таким образом, можно предположить, что, по крайней мере, Cur1 иHsp42 влияют на прионы независимо друг от друга.102АБВРисунок 38. Усиление [PSI+] при сверхэкспрессии CUR1 не зависит от Ydj1 и Hsp42.Сверхэкспрессию CUR1, YDJ1, HSP42, HSP42-mCherry или HSP26-mCherry с плазмидpRS425-CUR1,YEplac181-YDJ1,pAG415GPD-Hsp42,pAG415GPD-Hsp42-mCherryиpAG415GPD-Hsp26-mCherry, соответственно, анализировали в тест-системе (А, слева), с помощьюотпечатков (А, справа) или с помощью серий пятикратных разведений на указанных селективныхсредах (Б).
mC – mCherry. B. GT81-1C (HSP42) или изогенный штамм GT859 с делецией HSP42(hsp42Δ) трансформировали pRS426-CUR1 (↑↑CUR1), pAG416GPD-Btn2 (↑↑BTN2) или pRS426(вектор). Представлены репрезентативные серии пятикратных разведений трансформантов.3.5.6. Влияние Cur1 на прионы [PSI+] и [URE3] компенсируетсякоэкспрессией SIS1Известно, что Cur1 функционально взаимодействует с Sis1 и влияет на еговнутриклеточную локализацию, усиливая его импорт в ядро (Malinovska et al., 2012).Известно, что сверхэкспрессия SIS1 компенсирует вызываемое Cur1 изгнание[NRP1C+] и [URE3]. Чтобы проверить, происходит ли то же самое и с эффектомусиления [PSI+], мы коэкспрессировали CUR1 и SIS1 в штаммах [PSI+] и [URE3].Оказалось, что дополнительная продукция Sis1 приводит к снижению влияниясверхэкспрессии CUR1 как на [PSI+], так и на [URE3] (Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
