Диссертация (1145681), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Также две плазмиды,(YЕp13-2084 из данной работы, и YEp13-4838, описанная А.В. Архипенко, 2009),содержали последовательность гена MCM1.683.2. Сверхэкспрессия естественной супрессорной тРНКTrp ослабляетсинтетическую летальностьКонструкция 184-2 единственная приводила к снижению синтетическойлетальности, причём наблюдаемое восстановление жизнеспособности гибридовбыло выражено сильнее при скрещивании с мутантами sup45-107 (Рис. 11). Нафрагменте хромосомы, идентифицированном в составе плазмиды YEp13-184-2присутствует ген tW(CCA)-G1, кодирующий триптофановую тРНК. Посколькуизвестно, что присутствие супрессорных тРНК способно кодон-специфическиослаблять синтетическую летальность (Kiktev et al., 2007), мы предположили, чтоприсутствие множества дополнительных копий немутантных тРНК, которые могутявляться естественными супрессорами, в том числе и тРНКTrp, может приводить каналогичным эффектам.
Чтобы проверить эту гипотезу, мы переклонировали генtW(CCA)-G1вмультикопийныйвекторpRS425.ТрансформантыpRS425-tW(CCA)-G1, также как и YEp13-184-2, демонстрировали аналогичноеснижение синтетической летальности, более выраженное при скрещивании смутацией sup45-107, чем с другими мутациями sup45 (Рис. 12). Кроме того,присутствие обеих плазмид одинаково усиливало супрессию ade1-14 (TGA) как в[PSI+], так и в [psi–] штаммах, но не приводило к супрессии trp1-289 (TAG) (Рис.
12).Таким образом, обнаруженное в данной работе уменьшение синтетическойРисунок 12. Снижение синтетической летальности вызвано сверхэкспрессией tW(CCA)-G1.Штаммы OT56 ([PSI+]S) и 2-OT56 ([psi–]) были трансформированы указанными плазмидами;трансформантов анализировали в тест-системе (скрещивали со штаммами U-1A-D1628, несущимиуказанные аллели SUP45) и оценивали рост на средах, не содержащих аденин (показан ростштамма OT56 после 2-х дней, а 2-OT56 – после 7-ми дней инкубации) или триптофан (21 день).69летальностиобусловленосверхэкспрессиейгенаестественнойсупрессорнойтРНКTrp.3.3. Влияние TEF2 и генов других факторов элонгации трансляции насинтетическую летальность и нонсенс-супрессиюАнализ нуклеотидных последовательностей, полученных при секвенированииконцевых районов плазмиды YEp13-1317, показал, что она содержит участокхромосомы II, содержащий гены TEF2, MUD1, CBP6, GRS1 и MRPL36.
Ранееаналогичная конструкция YEp13-21 была идентифицирована при скрининге той жегеномнойбиблиотеки,направленномнапоискгенов,ухудшающихжизнеспособность нонсенс-мутантов sup45-105 (Мурина, 2008), однако конкретныйген, отвечающий за наблюдаемый эффект, выявлен не был. Мы проверили, влияет лисверхэкспрессия каждого из генов, присутствующих на вставке на синтетическуюлетальность, но не обнаружили влияния ни в одном из случаев (Рис. 13).Рисунок 13. Гены, изолированные с из плазмиды геномной библиотеки не влияют насинтетическую летальность. TEF2, MUD1, CBP6 и MRPL36 были переклонированы из YEp13-21в pRS425 (Москаленко С.Е., неопубликованные данные).
Полученными плазмидамитрансформировали штамм OT56 и анализировали трансформантов в тест-системе.Наибольший интерес для нас представлял ген TEF2, так как он, как и егопаралог TEF1, кодирует фактор элонгации трансляции eEF1A. Ранее показано, чтоeEF1A влияет на эффективность терминации трансляции, что проявляется какснижение уровня нонсенс-супрессии при инактивации одного из генов TEF1 илиTEF2 (Song et al., 1989). Известно также, что TEF2 усиливает синтетическуюлетальность мутации sup45-sl23ts и SUP35C (Valouev et al., 2009). Поэтому, мы70предположили, что среди генов, присутствующих на вставке, именно TEF2 влияет насинтетическую летальность, а отсутствие эффекта от введения вектора pRS425-TEF2связано с присутствием на нём участка промотора TEF2 (256 п.н.), по-видимому,недостаточного для обеспечения нормальной экспрессии гена (П.Б.
Дроздова, личноесообщение). Чтобы подтвердить это предположение, мы проанализировали втест-системе мультикопийный вектор YEplac181-TEF2, который содержит болеепротяжённый участок 5’-проксимально рамке считывания TEF2 (Valouev et al., 2009).Так как известно, что другие факторы элонгации трансляции также могут влиять нанонсенс-супрессию и на эффективность работы факторов терминации трансляции(Kinzy & Woolford, 1985; Carr-Schmid et al., 1999; Valouev et al., 2009), мы такжепроверили аналогичные конструкции для сверхэкспрессии TEF3 (CAM1), TEF4 иTEF5 (EFB1).
Оказалось, что введение дополнительных копий гена TEF2действительно усиливает синтетическую летальность (Рис. 14А). Остальныефакторы элонгации приводили к едва заметному улучшению роста гибридов.Одновременно, мы проверяли влияние тех же конструкций на нонсенс-супрессию вштамме [PSI+]. Как и ожидалось, TEF2 усиливал супрессию, а остальные факторыэлонгации приводили к её заметному снижению (Рис. 14А, правая панель).
Такимобразом, антисупрессия, вызванная повышенной продукцией некоторых факторовэлонгации, слабо детектируется с помощью теста на синтетическую летальность, чтонеобходимо учитывать при дальнейшем использовании теста.Сконцентрировавшись на изучении TEF2, мы предположили, что егосверхэкспрессия может приводить к усилению нонсенс-супрессии и у штаммов смутациями sup45. Для проверки данной гипотезы мы сверхэкспрессировали TEF2 вмутантах sup45-113 и sup45-115. Действительно, штаммы с мутантными аллелямиsup45 в присутствии TEF2 росли лучше на средах для оценки супрессии (Рис. 14Б).Таким образом, мы показали, что TEF2, по-видимому, является универсальнымаллосупрессором, так как он усиливает супрессию как на фоне [PSI+], так и на фонемутаций sup45.71АБРисунок 14.
Влияние генов факторов элонгации на синтетическую летальность инонсенс-супрессию. А. Результаты скрещиваний штамма ОТ56 ([PSI+]S), трансформированногоплазмидами для сверхэкспрессии TEF2, TEF3, TEF4 или TEF5, со штаммами L-1A-D1628,несущими указанные аллели SUP45. Б. Штаммы 1B-D1606 (SUP45), 113-1B-D1606 (sup45-113) и115-1B-D1606 (sup45-115) трансформировали плазмидами YEplac195-TEF2 или YEplac195(контроль). Полученных трансформантов проверяли по способности расти на указанныхселективных средах.3.4.
Влияние генов MCM1, SFP1 и других Q/N-богатых транскрипционныхфакторов на синтетическую летальностьСреди генов, обнаруженных в плазмиде YEp13-2084, наиболее вероятнымкандидатом на роль гена, сверхэкспрессия которого может усиливать синтетическуюлетальность, является MCM1. Он кодирует регулятор транскрипции из семействаMADS, который может действовать как активатор или репрессор генов, зависимых оттипа спаривания (Elble & Tye, 1991). Белок Mcm1 состоит из 286 аминокислотныхостатков, но для выполнения им функции регулятора транскрипции достаточноN-концевого участка (аминокислотные остатки 1–96) (Bruhn et al., 1992), в то времякак его С-концевой район обогащен остатками глутамина (Q) и аспарагина (N), чторанее позволило отнести Mcm1 к потенциально прионогенным белкам (Michelitsch &Weissman, 2000).
Далее мы проанализировали влияние не только Mcm1, но и другихQ/N-богатых регуляторов транскрипции на синтетическую летальность.723.4.1. Влияние гена MCM1 на синтетическую летальностьГен MCM1 и его С-терминальный Q-богатый домен были встроены в вектор,позволяющий конститутивно экспрессировать ген или его фрагмент на высокомуровне под контролем промотора GPD. При такой сверхэкспрессии MCM1 мыувидели только очень слабое влияние полноразмерной аллели на синтетическуюлетальность (Рис. 15А) и наблюдали небольшое снижение жизнеспособности у всехгибридовприсверхпродукцииC-домена(MCM1ΔN)(Рис.15Б).Однакосверхэкспрессия MCM1 под контролем индуцибельного промотора CUP1 приводилак явному усилению синтетической летальности (Рис.
15В).АБВРисунок 15. Индукция экспрессии MCM1 усиливает синтетическую летальность.Сверхпродукция генов MCM1(A) и MCM1ΔN(Б) в штаммах 2-OT56 [psi–], ОТ56 [PSI+]S и ОТ55[PSI+]W, которые были трансформированы плазмидами pGPD-MCM1(А) и pGPD-MCM1ΔN (Б). B.Cверхпродукция MCM1 под контролем промотора CUP1. Для индукции экспрессии в средудобавлено 150μM CuSO4. Приведены результаты скрещиваний трансформантов со штаммами серииL-1A-D1628.733.4.2.ВлияниеQ/N-богатыхтранскрипционныхфакторовнасинтетическую летальность и нонсенс-супрессиюМы проверили, влияет ли сверхэкспрессия генов других Q/N-богатыхтранскрипционных факторов и РНК-связывающих белков под контролем промотораCUP1 на синтетическую летальность [PSI+] с мутациями sup45. В качестве контроляиспользовали ген GFP под контролем того же промотора.
Мы также провериливлияние генов SWI1 и SCH9, слитых с геном EYFP и сверхэкспрессированных смультикопийных плазмид под контролем конститутивного промотора GPD.Оказалось, что увеличение экспрессии генов CYC8, PGD1, NRP1, PAB1, PIN3, VTS1 иSCH9, как и GFP, не приводило к нарушению жизнеспособности гибридов (Рис. 16А,обозначены чёрным цветом). Гены ABF1, FKH2, REB1, NAB2 и SWI1 существенноснижали жизнеспособность гибридов (Рис.
16А, обозначены жёлтым цветом), что непозволило определить влияют ли они на синтетическую летальность. Некоторые изфакторов, также как MCM1, усиливали синтетическую летальность, наиболеевыраженный эффект проявляли гены GLN3, MOT3, MCM1 и SFP1 (Рис. 16A,обозначены зелёным цветом). Исходно мы использовали аллель SFP1-fs636, котораясодержит сдвиг рамки считывания в 636м кодоне, который приводит кпоследующему появлению стоп-кодона и синтезу укороченного белка.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
