Диссертация (1145681), страница 14
Текст из файла (страница 14)
ЭкспрессияаллелиSFP1дикоготипавызывалаещёболеевыраженноеснижениежизнеспособности гибридов (Рис. 16Б), а её более сильная сверхэкспрессия смультикопийной плазмиды вызывала ухудшение роста даже на фоне немутантногоSUP45 (Рис. 16Б). Чтобы убедиться, что частичный эффект сверхэкспрессииSFP1-fs636 не вызван возможной супрессией мутации сдвига рамки считывания вштамме [PSI+], нами в аналогичный вектор была клонирована аллель SFP1ΔС(636),которая не содержит 3’-конца гена после данной мутации. СверхэкспрессияSFP1ΔС(636) приводила к аналогичным эффектам в тесте на синтетическуюлетальность, что и SFP1ΔС(636) (Рис.
16В, левая панель), и также приводила кнебольшому усилению супрессии в штамме OT56 (Рис. 16В, правая панель).74АБВРисунок 16. Влияние сверхэкспрессии генов Q/N-богатых транскрипционных факторов насинтетическую летальность. Штамм ОТ56 был трансформирован плазмидами серии pU суказанными генами под контролем промотора CUP1 (А, Б, В), а также p426GPD-SWI1-YFP(↑↑SWI1-Y), p426GPD-SCH9-YFP (↑↑SCH9-Y) и pRS426-SFP1 (2μ, pSFP1-SFP1). Зелёным шрифтомотмечены гены, сверхэкспрессия которых усиливает синтетическую летальность, а жёлтым – гены,ухудшающие рост штаммов. Трансформантов анализировали в тест-системе (А, Б, В; скрещиваниясо штаммами U-1A-D1628) и с помощью отпечатков на селективную среду с добавлением 150μMCuSO4 (В, правая панель).75Мы также проверили, влияет ли штамм, от которого диплоид наследуетплазмиды, на рост гибридов.
Для этого мы трансформировали производные штамма1A-D1628 плазмидами для сверхэкспрессии GLN3, MOT3, MCM1 и SFP1 искрещивали полученные клоны с OT55 и OT56. При такой постановке скрещиваний,сверхэкспрессия соответствующих генов в 113-1A-D1628 и 115-1A-D1628 такжеприводила к ухудшению роста гибридов (Рис. 17). Кроме того, мы оценили влияниеповышенной экспрессии FKH2, GLN3, MCM1, MOT3 и SFP1-fs636 на супрессию вштаммах с мутациями sup45, но не смогли обнаружить различий между клонами сосверхэкспрессией и без неё, так как анализ был существенно затруднён из-заснижения скорости роста мутантов sup45 в условиях сверхэкспрессии этих генов(данные не представлены).Рисунок 17.
Эффекты генов Q/N-богатых транскрипционных факторов на синтетическуюлетальность не зависят от штамма, трансформированного вектором для сверхэкспрессии.Производные штамма 1A-D1628, несущие указанные мутации sup45, трансформировалиплазмидами с указанными генами под контролем промотора CUP1, после чего скрещивали соштаммами ОТ56 (S – [PSI+]S) или ОТ55 (W – [PSI+]W).
Экспрессию генов индуцировалидобавлением в среду 150μM CuSO4.3.4.3. Характеристика Q/N-богатых транскрипционных факторов по ихвлиянию на жизнеспособность штаммов и супрессиюДля оценки влияния проанализированных транскрипционных факторов нажизнеспособность, мы сверхэкспрессировали кодирующие их гены в штаммах OT5576([PSI+]W[PIN+]), 1-OT56 ([psi–][PIN+]) и 2-OT56 ([psi–][pin–]), и скрестили полученныхтрансформантов с тестерными мутантами sup45. Оказалось, что сверхэкспрессиягенов ABF1, FKH2 и REB1 приводила к понижению жизнеспособности гибридов вовсех проанализированных штаммах.
Мы также оценили ухудшение роста присверхэкспрессии генов Q/N-богатых транскрипционных факторов с помощьюпоследовательных кратных разведений. Снижение жизнеспособности сильнее всегопроявлялось в штамме ОТ56, несущем сильный вариант приона [PSI+]S, посравнению со штаммом ОТ55, содержащим слабый вариант [PSI+]W, и с 2-OT56([psi–]) (Рис. 18). Стоит также отметить, что конструкции с FKH2 и REB1 обладалиболее выраженным эффектом по сравнению с ABF1, так как приводили к гибелиРисунок 18.
Влияние Q/N-богатых транскрипционных факторов на рост изогенных штаммовдрожжей. Штаммы ОТ56 ([PSI+]S), OT55 ([PSI+]W) и 2-OT56 ([psi–]) были трансформированыплазмидами серии pU с указанными генами. Трансформантов анализировали с помощью серийпятикратных разведений на указанных средах. Для индукции экспрессии генов в селективнуюсреду без урацила добавляли 100μM CuSO4.
Зелёным шрифтом отмечены гены, сверхэкспрессиякоторых усиливает синтетическую летальность, а жёлтым – гены, ухудшающие рост штаммов.77клеток с [PSI+]S даже в отсутствие ионов меди, т.е. при очень низком уровнеэкспрессии (Рис. 18). Остальные проверенные гены не влияли заметно нажизнеспособность штаммов ОТ56 и ОТ55.Мы также проверили влияние сверхэкспрессии транскрипционных факторов нанонсенс-супрессию в штаммах [PSI+].
Супрессорный эффект [PSI+] в обоих штаммахусиливался только при сверхэкспрессии MCM1 и SFP1-fs636 (Рис. 19), которые,таким образом, являются аллосупрессорами [PSI+].Рисунок 19. Влияние сверхэкспрессии генов Q/N-богатых транскрипционных факторов насупрессию в штаммах [PSI+]. Штаммы ОТ56 ([PSI+]S) и OT55 ([PSI+]W) были трансформированыплазмидами серии pU с указанными генами. Трансформантов анализировали с помощью серийпятикратных разведений на селективных средах с добавлением 150μM CuSO4. Рост штаммов насредах, не содержащих аденин, оценивали на 2й и 3й день у штамма OT56 и на 14й день у OT55.Зелёным шрифтом отмечены гены, сверхэкспрессия которых усиливает синтетическуюлетальность, а жёлтым – гены, ухудшающие рост штаммов.783.4.4.Q/N-богатыетранскрипционныефакторымогутвлиятьнаэкспрессию SUP35 и SUP45Чтобы убедиться в том, что аллосупрессия [PSI+] вызвана регуляциейтранскрипции со стороны Sfp1 и Mcm1, мы провели количественный анализ мРНКгенов SUP35 и SUP45, кодирующих факторы терминации трансляции.
Оказалось, чтосверхэкспрессия МСМ1 усиливает транскрипцию SUP35, но не влияет на SUP45, аSFP1-fs636 увеличивает экспрессию обоих генов (Рис. 20А). СверхэкспрессияSFP1-fs636 не приводила к изменениям в уровнях белков Sup35 и Sup45, причём внеАБBРисунок 20. Влияние SFP1 на экспрессию генов, кодирующих факторы терминациитрансляции. А. Результаты количественной ОТ-ПЦРРВ при сверхэкспрессии SFP1-fs636, MCM1,GLN3 и MOT3 в штамме OT56.
Б, B. Вестерн-блоты с детекцией Sup35, Sup45 и Tub1 в штаммахОТ56 ([PSI+]S) и 2-OT56 ([psi–]). Б. Анализировались трансформанты pU-SFP1-fs636 или pRS316(вектор) после 4 часов роста в жидкой среде, в присутствии или отсутствии 50μM CuSO4, додостижения логарифмической (лог.; OD600=0,5–0,7) или стационарной (стац.; OD600=1,0–1,2) фазыроста. В.
Белки, выделенные из трансформантов pRS426-SFP1 или pRS426 (контроль). Справапредставлены результаты денситометрии пяти независимых измерений Sup35 и Sup45относительно Tub1. *, p<0,05.79зависимости от фазы роста культуры (логарифмическая и стационарная) как вштамме [PSI+], так и [psi–].Тем не менее, сверхэкспрессия аллели SFP1 дикого типаприводила к более выраженному увеличению количества белка Sup35, чем Sup45(Рис.
20Б). Мы также проверили влияние сверхэкспрессии GLN3 и MOT3 на уровнимРНК и белков факторов терминации трансляции. Индукция экспрессии генов GLN3и MOT3 приводила к небольшому увеличению уровня мРНК SUP35, а влияние наэкспрессию гена SUP45 было крайне незначительным (Рис.
20А). При этом, как и вслучае SFP1-fs636, нам не удалось детектировать существенного влияния на уровнибелков Sup35 и Sup45.Чтобы проверить, связано ли усиление синтетической летальности с усилениемэкспрессии SUP35, мы проверили различные конструкции для экспрессии SUP35 втест-системе синтетической летальности. Действительно, добавление всего однойдополнительной копии SUP35 под собственным промотором на центромернойплазмиде приводило к усилению летальности, схожему по степени с тем, чтонаблюдается при индуцированной экспрессии SFP1-fs636 (Рис. 21). Аналогичныерезультаты давало присутствие в штамме SUP35NM-GFP или SUP35-N-GFP-MC,экспрессируемых под контролем CUP1, но без добавления в среду дополнительногоCuSO4, то есть при низком уровне экспрессии указанных аллелей.
Однакоповышение экспрессии этих вариантов при индукции ионами Cu2+ приводило кРисунок 21. Дополнительная экспрессия SUP35 приводит к усилению синтетическойлетальности. Штамм OT56 ([PSI+]S) был трансформирован pmCUP-NM-GFP (SUP35NM-GFP),pUCNGMC (SUP35N-GFP-MC), pRS316CG (GFP), pRSU2 (pSUP35-SUP35), pRSU4 (2μ,pSUP35-SUP35), pRS426 (вектор) или pRS426-SFP1 (2μ, pSFP1-SFP1). Трансформантованализировали в тест-системе.
Для индукции промотора CUP1 в среду добавляли 150μM CuSO4.80сильному снижению жизнеспособности гибридов. Сверхэкспрессия SUP35 намультикопийной плазмиде существенно снижала жизнеспособность и скорость ростагаплоидов, что, вероятно, и явилось причиной полной нежизнеспособности гибридов(Рис. 21). Таким образом, усиление синтетической летальности, вызванноесверхэкспрессией GLN3, MOT3, MCM1 и SFP1 может являться следствиемповышения экспрессии SUP35 в штамме [PSI+].3.4.5. SFP1 вызывает токсичность приона [PSI+] и влияет на агрегацию Sup35Мы более подробно изучили влияние SFP1 на прион [PSI+]. Выяснилось, чтосверхпродукция полноразмерного белка Sfp1, но не его укороченного вариантаSfp1ΔС (продукта гена SFP1-fs636) приводит к прион-зависимой летальности (Рис.22).Рисунок 22.
SFP1 приводит к [PSI+]-зависимой летальности. Сверхэкспрессия SFP1 иSFP1-fs636 в штаммах OT56 ([PSI+]S) и 2-OT56 ([psi–]). Для индукции промотора CUP1 в средудобавляли 150μM CuSO4. Использованы плазмиды (сверху вниз): pU-SFP1, pU-SFP1-fs636, pRS426,pRS426-SFP1. Представлены серии 10-кратных разведений.Мы показали, что сверхэкспрессия SFP1 приводит к увеличению количестваSup35 в клетках (Рис. 20В), что может влиять на свойства [PSI+], так какдополнительная экспрессия SUP35 может нарушить баланс между уровнямимономерного и агрегированного Sup35. Чтобы проверить эту гипотезу, мы провелиэксперименты по осаждению Sup35 из лизатов клеток.
Выяснилось, что81сверхэкспрессия SFP1 приводила к увеличению доли Sup35 в осадочной фракции, поотношению к растворимому белку (Рис. 23А). Чтобы убедиться, что увеличениеSup35втяжёлойфракциисвязаносегоприонизацией,мыпровелиполуколичественный SDD-AGE в сочетании с SDS-PAGE. Выяснилось, что общееувеличениеколичестваSup35действительносопровождаетсяувеличениемколичества SDS-устойчивых агрегатов этого белка. Это увеличение, однако, неотражается на распределении агрегатов по размеру (Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
