Диссертация (1145681), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Образцы наносили без предварительного кипячения (Н) или послекипячения (100 °C) в течение 5 минут. Представлены результаты вестерн-блот гибридизации сантителами против CFP (сверху) или Sup35 (снизу).88температуре, либо при 100 °C в течение 5 минут. Оказалось, что Sfp1-Ceruleanдействительно формирует SDS-устойчивые агрегаты, которые нестабильны прикипячении в присутствие SDS (Рис.
28). Анализ распределения агрегатов [PSI+] в техже образцах показал, что, в отличие от сверхэкспрессии SFP1 с мультикопийнойплазмиды под контролем собственного промотора, индуцированная экспрессияSFP1-Cerulean приводит к увеличению размера агрегатов Sup35 (Рис.
28).Коэкспрессия SIS1, которая компенсирует вызываемую Sfp1 прионную токсичность,приводила к тому, что и распределение агрегатов Sup35 по размеру возвращалось кнорме (Рис. 28). Стоит отметить, что сверхэкспрессия SIS1 не влияла на размерагрегатов самого Sfp1-Cerulean, что говорит о том, что при компенсации токсичностиSIS1, вероятно, влияет именно на агрегаты Sup35, а не на Sfp1.Для того, чтобы проверить это предположение, мы проанализировалилокализацию Sis1, Sfp1 и Sup35 in vivo. Флуоресцентная микроскопия выявила, чтоSis1-mCherry частично колокализуется с Sfp1-GFP или Sfp1-Cerulean (Рис.
29А),однако фенотипическая проверка показала, что С-терминально маркированныеварианты Sis1 (Sis1-EGFP и Sis1-mCherry) оказались неспособны компенсироватьприонную токсичность, вызванную как сверхэкспрессией SFP1 (Рис. 30), так иSUP35 (Рис. 26). При этом, C-терминально маркированные варианты Sfp1 (Sfp1-GFPи Sfp1-Cerulean) сохраняли функциональность, так как их сверхпродукция приводилак токсичности [PSI+] в той же мере, что и сверхэкспрессия нативного SFP1 (Рис. 30).Мы также проверили, влияет ли сверхэкспрессия SFP1 на характер локализацииагрегатов[PSI+].продуцировалиДлявизуализацииSup35NM-GFP илипредсуществующиеагрегатыагрегатов[PSI+]Sup35N-GFP-MC,Sup35,позволяяихмыкоторыекратковременно«декорируют»обнаружениеметодамифлуоресцентной микроскопии.
Сверхэкспрессия SFP1 как с мультикопийнойплазмиды под контролем собственного промотора (данные не представлены), так ипод контролем промотора CUP1 (Рис. 29Б) не приводила к заметным изменениям влокализацииагрегатовSup35.Использование89химернойконструкцииАБРисунок 29. Sfp1 частично колокализуется с Sis1 и c агрегатами [PSI+]. Флуоресцентнаямикроскопия клеток OT56 ([PSI+]S[PIN+]) или 2-OT56 ([psi-][pin-]), трансформированныхpR16CUP-SFP1-Cerulean или pU-SFP1-GFP вместе с pAG415GPD-Sis1-mCherry (А) илиpRS315CUP-SFP1-mCherry или pRS315CmC вместе с pmCUP-NM-GFP (↑SUP35NM-GFP) илиpUCNGMC (↑SUP35N-GFP-MC) (Б). Представлены репрезентативные изображения с каналов CFP(А), GFP, mCherry, BF (А, Б) и совмещения указанных каналов. Клетки визуализировали после 4часов роста в среде с добавлением 50 μM CuSO4.90SFP1-mCherry показало, что Sup35 и Sfp1 частично колокализуются в штамме [PSI+].Однако, сверхпродукция Sfp1-mCherry в штамме [psi–] не приводила к изменениюдиффузного характера флуоресценции как Sup35NM-GFP, так и Sup35N-GFP-MC(Рис.
29Б), что говорит о том, что, по-видимому, мономерная форма Sup35 неспособна напрямую взаимодействовать с агрегатами Sfp1 in vivo, в то время какобратный процесс (вовлечение Sfp1 в агрегаты [PSI+]) может иметь место.Рисунок 30. Sfp1-GFP и Sfp1-Cerulean способны вызывать [PSI+]-зависимую токсичность,однако Sis1-EGFP и Sis1-mCherry не способны её компенсировать.
Штамм OT56 былтрансформирован YEp351-SIS1(↑↑SIS1),pAG415ADH1-Sis1-EGFP (↑SIS1-EGFP)илиpAG415GPD-Sis1-mCherry (↑SIS1-mCherry) в сочетании с pRS426-SFP1 (↑↑SFP1), pU-SFP1-GFP(↑SFP1-GFP) или pR16CUP-SFP1-Cerulean (↑SFP1-Cerulean); векторы – YEp351 и pRS316. Дляиндукции промотора CUP1 в среду добавляли 150μM CuSO4.
Приведены репрезентативные серии10-кратных разведений.913.5. Влияние генов HLJ1, CUR1, других шаперонов и ассоциированных сними факторов на синтетическую летальностьКонструкции YЕp13-1825 и YЕp13-5618 из геномной библиотеки содержатобщий участок, в который входит ген HLJ1, кодирующий ассоциированный смембраной ЭПР шаперон из семейства Hsp40.
Кроме того, ранее при анализерезультатов скрининга геномной библиотеки был выявлен ген CUR1, кодирующийфактор сортинга шаперонов. Известно, что различные группы шаперонов иассоциированных с ними факторов играют важную роль в поддержании прионовдрожжей, и мы далее подробно изучили эффекты, которые определённые шапероныоказывают на синтетическую летальность.3.5.1. Сверхэкспрессия HLJ1, CUR1 и BTN2 усиливает синтетическуюлетальностьДля того, чтобы установить, связан ли эффект плазмид YЕp13-1825 иYЕp13-5618 именно с присутствием на них гена HLJ1, нами была сконструированамультикопийная плазмида, на которой ген экспрессируется под контролемсобственного промотора.
Присутствие этой плазмиды значительно повышалосинтетическую летальность (Рис. 31А). Таким образом, сверхэкспрессия HLJ1вероятно может влиять на свойства приона [PSI+].РанеевработеА.В.Архипенкобылпоказананалогичныйэффектсверхэкспрессии гена CUR1 (Архипенко, 2009), который кодирует фактор сортингашаперонов, участвующий в транспорте белков-шаперонов между компартментамиконтроля укладки белков (PQC) IPOD и JUNQ (Malinovska et al., 2012). Мыпроанализировали эффекты гомолога CUR1, гена BTN2, который также участвует врелокализации шаперонов.
Выяснилось, что подобно CUR1, BTN2 усиливаетсинтетическую летальность (Рис. 31Б).92АБРисунок 31. Влияние генов HLJ1, CUR1 и BTN2 на синтетическую летальность. А. Результатыскрещиваний трансформантов штаммов ОТ55 и ОТ56 с производными 1A-D1628, несущимиуказанные аллели SUP45 на плазмидах с маркером URA3 (А) или LEU2 (Б). HLJ1, CUR1 и BTN2сверхэкспрессированы с плазмид pRS425-HLJ1, pRS426-CUR1 и pAG416GPD-BTN2,соответственно. pRS425 (А), pRS426 и pRS316 (Б) использованы в качестве контрольных векторов.3.5.2.
CUR1, но не BTN2 усиливает нонсенс-супрессию в штаммах [PSI+], ноне [psi–]Поскольку усиление синтетической летальности может свидетельствовать како влиянии на [PSI+], так и о влиянии на аппарат терминации трансляции, мыпроверили влияют ли CUR1 и BTN2 на нонсенс-супрессию в штаммах [psi–]. Сначаламы сверхэкспрессировали CUR1 и BTN2 в производных штамма 1B-D1606, которыенесут четыре нонсенс-мутации: ade1-14 (UGA), his7-1 (UAA), lys9-A21 (UAA) иtrp1-289 (UAG), а также содержат либо ген SUP45 дикого типа, либо мутацииsup45-101, -105, -107, -113 -115.
Ни CUR1, ни BTN2 не влияли на нонсенс супрессиюу мутантов sup45, в отличие от TEF2, сверхэкспрессия которого усиливаласупрессию всех четырёх нонсенс-мутаций (Рис. 32А). Кроме того, мы проверили,влияют ли CUR1 и BTN2 на фенотипическую супрессию в штамме 33G-D373,возникающую в присутствии паромомицина. Мы также не обнаружили различий вросте между штаммами, сверхэкспрессирующими CUR1 или BTN2, и штаммом сконтрольной плазмидой (Рис. 32Б).
Таким образом, CUR1 и BTN2, по-видимому,влияют не на процесс терминации трансляции, а на свойства приона [PSI+].93АБРисунок 32. Сверхэкспрессия CUR1 и BTN2 не влияет на нонсенс-супрессию в отсутствие[PSI+]. CUR1 или BTN2 были сверхэкспрессированы в штаммах 1B-D1606, несущих аллель SUP45дикого типа, либо мутации sup45-101, -105, -107, -113 или -115. Представлены репрезентативныесерии 10-кратных разведений 1B-D1606 и 113-1B-D1606, трансформированых pRS426-CUR1(↑↑CUR1), pAG416GPD-Btn2 (↑↑BTN2), YEplac195-TEF2 (↑↑TEF2) или pRS426 (вектор).Аналогичные результаты были получены на фоне остальных аллелей SUP45.
C. Штамм 33G-D373был трансформирован pAG415GPD-Cur1-EGFP (↑↑CUR1), pAG415GPD-Btn2-EGFP (↑↑BTN2) илиpRS315 (вектор). Одинаковые количества клеток были нанесены на среды с добавлением 0,2 мг/млпаромомицина или без него. 50-кратные разведения показаны только для SC-Leu и YEPD т.к. надругих средах для них роста не наблюдалось. Снизу указаны нонсенс-мутации в, маркирующиештаммы.Чтобы проверить, влияют ли CUR1 и BTN2 на фенотип [PSI+] мысверхэкспрессировали эти гены в штаммах OT56 и OT55, несущих сильный ([PSI+]S)ислабый([PSI+]W)вариантыприона,соответственно.Оказалось,чтосверхэкспрессия CUR1 усиливает супрессию в обоих штаммах, в то время как BTN2не влиял на неё (Рис.
33А). Экспрессия гена CUR1 индуцируется при тепловом шоке(Malinovska et al., 2012), а значит рост при повышенной температуре может привестик усилению эффектов CUR1. Чтобы проверить это предположение, мы оценилинонсенс-супрессию при росте штамма OT56 при 34 °C, и действительно, различия посиле супрессии мутации ade1-14 оказались более значительными при 34 °C, чем при30 °C (Рис. 33Б, верхний ряд). Трансформанты мультикопийной плазмидой, несущейCUR1 не сохраняли более сильную супрессию после изгнания плазмиды как из94штамма OT56, так и OT55 (Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
