Автореферат (1145680)
Текст из файла
На правах рукописиМатвеенко Андрей ГеоргиевичПоиск и изучение генов, влияющих на синтетическуюлетальность фактора [PSI+] и мутаций sup45 уSaccharomyces cerevisiaeспециальность: 03.02.07 – «генетика»АВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата биологических наукСанкт-Петербург2017Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном университете на кафедрегенетики и биотехнологии.Научный руководитель:доктор биологических наук, доцентЖуравлева Галина Анатольевнапрофессор кафедры генетики и биотехнологии Федерального государственного бюджетного образовательногоучреждениявысшегообразования«Санкт-Петербургский государственный университет»Официальные оппоненты:доктор биологических наукСаранцева Светлана Владимировназам. директора по научной работе, зав. лабораториейэкспериментальной и прикладной генетики Федерального государственного бюджетного учреждения«Петербургский институт ядерной физики им.
Б.П.Константинова», Национальный исследовательскийцентр «Курчатовский институт»кандидат биологических наукЖуков Владимир Александровичзаведующий лабораторией генетики растительномикробных взаимодействий Федерального государственного бюджетного научного учреждения«Всероссийский научно-исследовательский институтсельскохозяйственной микробиологии»Ведущая организация:Федеральное государственное бюджетное учреждениенауки «Институт цитологии» Российской академиинаукЗащита диссертации состоится «18» мая 2017 г. в 16:00 часов на заседаниидиссертационного совета Д.212.232.12 при Санкт-Петербургском Государственномуниверситете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ,биологический факультет, кафедра генетики и биотехнологии, аудитория 1.С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им.
М. ГорькогоСанкт-Петербургского государственного университета и на сайте СПбГУ(https://disser.spbu.ru/files/disser2/disser/my9J27WmMP.pdf).Автореферат разослан«Ученый секретарьдиссертационного советаД.212.232.12»2017 г.доктор биологических наукЛюдмила Андреевна МамонОбщая характеристика работы3Актуальность темы исследованияДрожжи Saccharomyces cerevisiae — удобный модельный объект для изучениягенетического контроля терминации трансляции и регуляции прионизации иамилоидогенеза.
Существует немного систем, позволяющих проводить направленныйпоиск новых факторов, влияющих на эти процессы. Тест-система синтетическойлетальности приона [PSI+] и мутаций в гене SUP45 является одной из таких систем,причём она позволяет выявлять даже слабое влияние на нонсенс-супрессию и нажизнеспособность прион-содержащих штаммов. Данное исследование посвященопоиску новых генов, продукты которых влияют на прионы и на терминациютрансляции, и дальнейшему изучению механизмов, лежащих в основе обнаруженныхэффектов некоторых выявленных генов.Степень разработанности темыВ терминации трансляции в клетках эукариот принимают участие два белка,eRF1 и eRF3, кодируемые у дрожжей S.
cerevisiae генами SUP45 и SUP35соответственно. Белок Sup35 (eRF3) способен формировать амилоидные агрегаты, чтоможет приводить к возникновению приона [PSI+] и, как следствие, к уменьшениюэффективности терминации трансляции. Ранее было показано, что присутствие вштаммах с сильным вариантом [PSI+] некоторых мутантных аллелей sup45 даже вгетерозиготном состоянии летально. Эта синтетическая летальность приона [PSI+] имутантных аллелей sup45 зависит от природы мутации и варианта приона. Этотфеномен был использован для разработки тест-системы, позволяющейидентифицировать белки, влияющие на стабильность приона [PSI+] и/или наэффективность терминации трансляции. С помощью этой тест-системы ранее былпроведён скрининг геномной библиотеки дрожжей и установлено, что дополнительнаяпродукция Sup45, С-терминального домена Sup35 или шаперона Hsp104 ослабляетсинтетическую летальность, а сверхэкспрессия гена CUR1, кодирующего факторсортинга шаперонов, усиливает её.
Известно, что избыток Cur1 приводит кэлиминации другого приона дрожжей, [URE3]. В настоящей работе тест-системасинтетической летальности использована для идентификации новых факторов,влияющих на точность терминации трансляции и на свойства приона [PSI+], и болееподробно рассмотрены механизмы влияния некоторых из этих факторов.Цель и задачи исследованияЦелью данной работы является поиск и изучение новых генов дрожжейSaccharomyces cerevisiae, влияющих на синтетическую летальность приона [PSI+] смутациями sup45. Для достижения поставленной цели были сформулированыследующие задачи:1. Идентифицировать новые гены, влияющие на синтетическую летальность, cпомощью ранее разработанной тест-системы с использованием скринингагеномной библиотеки;2.
Установитьвозможныемеханизмывлияниягенов-кандидатов,идентифицированных при этом скрининге;3. Проанализировать транскрипционную регуляцию генов, кодирующих факторытерминации трансляции;4. Изучить влияние системы клеточных шаперонов на поддержание прионовдрожжей.4Научная новизнаВ представленной работе впервые показано влияние генов SFP1 и MCM1 насвойства приона [PSI+], выявлен новый механизм прионной токсичности, связанной сувеличением уровня транскрипции гена SUP35, и обнаружена способность шаперонаSis1 компенсировать прионную токсичность [PSI+]. Установлен вероятный механизмвлияния фактора Cur1 на прионы, связанный с изменением клеточной локализацииSis1.Теоретическая и практическая значимость работыПолученные результаты уточняют границы применения теста на синтетическуюлетальность приона [PSI+] с мутациями sup45 и расширяют круг возможныхинтерпретаций результатов теста. Данные, полученные в настоящей работе, углубляютпонимание механизмов регуляции терминации трансляции и поддержания прионов удрожжей и могут быть использованы для дальнейших теоретических и практическихисследований терминации трансляции и при изучении механизмов амилоидогенеза иподдержания прионов, а также роли шаперонов в этих процессах.
Результаты работымогут быть использованы в курсах «Генетический контроль трансляции» и «Прионы»,преподаваемых на кафедре генетики и биотехнологии, а в также аналогичных курсах вдругих учебных заведениях.Методология и методы исследованияВ работе использованы стандартные методы генетики, микробиологии и геннойинженерии, биохимические методы, методы флуоресцентной микроскопии, а такжестатистические методы.Основные положения, выносимые на защитуСверхэкспрессиягеновестественныхсупрессорныхтРНКможеткодон-специфично снижать синтетическую летальность, что продемонстрировано напримере тРНКTrp. Избыток фактора элонгации трансляции eEF1A (Tef2) приводит кусилению нонсенс-супрессии, вызванной как [PSI+], так и мутациями sup45.Сверхэкспрессия генов, кодирующих транскрипционные факторы Sfp1, Mcm1, Gln3 иMot3 приводит к усилению экспрессии SUP35, что может приводить к усилениюнонсенс-супрессии и к прион-зависимой летальности в присутствии [PSI+].
Прионнаятоксичность [PSI+], вызванная сверхэкспрессией SUP35 или SFP1, компенсируетсясверхпродукцией шаперона Sis1. Фактор сортинга шаперонов Cur1 разнонаправленновлияет на дрожжевые прионы: усиливает фенотип [PSI+], но изгоняет прион [URE3].При этом в обоих случаях механизм действия связан с его способностью увеличиватьинтенсивность транспорта Sis1 в ядро. N-концевая последовательность Cur1 (c 3-го по22-й аминокислотный остаток) отвечает за быструю деградацию этого белка черезсистему клеточных протеасом.Степень достоверности и апробация результатовРезультаты диссертационной работы были представлены на 9 всероссийских имеждународных конференциях и опубликованы в 4 статьях в рецензируемых научныхизданиях.Обьём и структура работыДиссертация состоит из введения, пяти глав и списка литературы.
Полный объёмдиссертации составляет 148 страниц с 46 рисунками и 8 таблицами. Списоклитературы содержит 231 наименование.Содержание работы5Материалы и методыВ работе использованы стандартные методы культивирования микроорганизмов(Kaiser et al., 1994). Для амплификации плазмид использовали штамм Escherichia coliDH5α (Hanahan, 1985). Бактерий культивировали при 37 °С на твёрдой и жидкойсредах LB с добавлением ампициллина до концентрации 100 мкг/мл (Sambrook et al.,1989).
Дрожжи культивировали при 30 °С на твёрдой и в жидкой полной среде YEPD ина селективных средах SC на основе YNB (Invitrogen), содержащих необходимыедобавки (Захаров и др., 1984; Sherman et al., 1986). Для индукции промотора CUP1 всреду добавляли 50-150 мкМ CuSO4. Трансформацию дрожжей проводили по методуGietz et al., 2002.В работе использованы изогенные производные штамма S. cerevisiae 74-D694(MATa ade1-14(UGA) trp1-289(UAG) ura3-52 his3-∆200 leu2-3,112) (Chernoff et al.,1995). Штаммы OT56 и OT55 содержат сильный и слабый варианты приона [PSI+],соответственно (Derkatch et al., 1997; Newnam et al., 1999).
Штаммы 1-OT56 и 2-OT56– [psi-][PIN+] и [psi-][pin-] варианты OT56, полученные в данной работе. Штамм[URE3], OT520/BY241, содержит вариант приона [URE3-1] (Brachmann et al., 2005).Для скрещиваний в тесте на синтетическую летальность использовалипроизводные штамма 1A-D1628 (MATα ade1-14(UGA) trp1-289(UAG) ura3-52 his3 lys2leu2-3,112 sup45::HIS3 [pRS316-SUP45]), содержащие аллель SUP45 дикого типа (WT)или мутантные аллели, которые поддерживаются на центромерных плазмидах (Рис.1,см.
Moskalenko et al., 2003; Москаленко и др., 2004).Для фенотипической оценки нонсенс супрессии использовался штамм 1B-D1606(MATα ade1-14(UGA) his7-1(UAA) lys9-A21(UAA) trp1-289(UAG) ura3-52 leu2-3,112gal10-1B) и его производные, несущие мутации sup45 (Moskalenko et al., 2003;Drozdova et al., 2016).Количественную OT-ПЦРРВ (обратную транскрипцию с последующей ПЦР врежиме реального времени) проводили на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad) сиспользованием набора реагентов Eva Green (Syntol). Для сравнения значенийизменения критического цикла относительно ACT1 (∆Cq) в опытных и контрольныхобразцах использовали критерий Вилкоксона-Манна-Уитни; * обозначает p<0,05.Флуоресценцию белков in vivo анализировали с помощью широкопольногомикроскопа Zeiss Axioscope A1 либо с помощью конфокального микроскопа Leica TSCSP5 MP. Изображения обрабатывали с использованием программного обеспечения Fijiи Adobe Photoshop.Метод полуденатурирующего электрофореза белков в агарозном геле (SDD-AGE)описан ранее (Kushirov et al., 2006).
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
