Автореферат (1145680), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Для того, чтобы проверить,происходит ли это в нашей системе, мы коэкспрессировали CUR1 и SIS1 в штаммах[PSI+] и [URE3]. Оказалось, что дополнительная продукция Sis1 приводит кисчезновению влияния сверхэкспрессии CUR1 как на [PSI+], так и на [URE3] (Рис.8А,Б), причём для компенсации более сильных эффектов сверхэкспрессии какнормального CUR1, так и аллели cur1Δ3-22, требуется более высокий уровеньэкспрессии Sis1 (Рис. 8А,Б,В).Мы также показали, что Cur1 и Sis1 колокализуются в большинстве клеток (Рис.9А), причём сверхэкспрессия нормальной аллели CUR1 приводит к тому, что Sis1локализуется в ядре примерно в половине клеток, в то время как сверхэкспрессияcur1Δ3-22 повышает долю клеток с локализованным в ядре Sis1 до 75% (Рис.
9Б).Доля клеток, в которых наблюдается релокализация Sis1, существенно снижена придополнительной экспрессии Sis1 на фоне интактной хромосомной копии гена (Рис. 9Б).Поскольку коэкспрессия Sis1, с одной стороны, компенсирует эффекты Cur1 наприоны, а с другой – приводит к снижению релокализации Sis1, мы предполагаем, чтовлияние гена CUR1 на прионы связано с его активностью по релокализации шаперонаSis1 в ядро.
Вероятно, транспорт Sis1 в ядро приводит к невозможности его15Рисунок 8. Влияние CUR1 на прионы [PSI+] и [URE3] компенсируется коэкспрессиейSIS1. A, Б. Штаммы OT56 и OT520 были трансформированы плазмидами длясверхэкспрессии вариантов CUR1 и SIS1. Трансформантов анализировали с помощью серийпятикратных разведений на селективных средах при 30° C или 34° C. В. Подсчёт частотыпотери приона [URE3] при сверхэкспрессии CUR1 или cur1Δ3-22 и различных уровняхэкспрессии SIS1.
SIS1-EG и SIS1-mC обозначают SIS1-EGFP и SIS1-mCherry соответственно.связывания с прионными агрегатами, и, таким образом, чем больше Sis1 оказывается вядре, тем больше усиливается фенотип [PSI+] и тем менее стабильным оказываетсяприон [URE3].Анализ уровней белков различных вариантов Cur1 показал, что Cur1Δ3-22детектируется в значительно большем количестве, чем полноразмерный белок.Поскольку известно, что Cur1 быстро деградирует по убиквитин-протеасомномумеханизму, мы проверили, не связан ли больший уровень Cur1Δ3-22 с нарушениемпротеолиза. При добавлении блокатора протеасом MG132 мы наблюдали увеличениеактивности Cur1 по релокализации Sis1 в ядро, однако активность Cur1Δ3-22оставалась прежней (Рис.
10А,Б). Уровень белка Cur1 также увеличивался придействии MG132, при том что уровень Cur1Δ3-22 оставался прежним (Рис. 10В).А16БРисунок 9. Сверхпродукция Cur1 усиливает транспорт Sis1 в ядро. А. Флуоресцентнаямикроскопия клеток ОТ56, сверхэкспрессирующих указанные аллели CUR1 и SIS1.NucBlue – окраска ядерной ДНК. Б. Оценка среднего числа клеток из четырёх полей зрения спреимущественно ядерной локализацией Sis1 в штаммах GT1903-3B (ген SIS1 на хромосомеслит с GFP) и OT56, дополнительно экспрессирующем SIS1-EGFP на фоне интактнойхромосомной копии SIS1. Планки погрешностей обозначают доверительные интервалы,рассчитанные по t-критерию Стьюдента (уровень значимости 0,05). mC – mCherry.Таким образом, можно предположить, что N-терминальный район белка Cur1 (с 3-й по22-ю аминокислоты) играет существенную роль в деградации Cur1 через системупротеасом клетки.Заключение.В результате скрининга сверэкспрессионной библиотеки генов нам удалосьустановить влияние 10-ти плазмид на синтетическую летальность [PSI+] с мутациямиsup45.
Одна из плазмид снижает синтетическую летальность, что связано сприсутствием в её последовательности гена триптофановой тРНК (tW(CCA)G1),которая выступает в роли мультикопийного супрессора. Нам удалось установить гены,ответственные за наблюдаемое усиление синтетической летальности, в четырех изоставшихся девяти плазмид. Это HLJ1 (присутствует на двух плазмидах), MCM1 иTEF2. Анализ оставшихся пяти плазмид может также позволить выявить новыефакторы, влияющие на терминацию трансляции или на прионы.При изучении влияния Mcm1 на синтетическую летальность мы обнаружили, чтодругой регулятор транскрипции, Sfp1, схожим образом влияет на синтетическуюлетальность и на прион [PSI+]. Сверхпродукция обоих белков приводит к увеличениюэкспрессии SUP35, что может приводить к усилению приона [PSI+].
Мы предполагаем,что влияние MCM1 и SFP1 на синтетическую летальность является одним изпроявлений их функций в регуляции транскрипции гена SUP35 и, возможно, SUP45.Несмотря на обогащённость остатками глутамина, ни один из тестов в работе Alberti etal., 2009 не указал на прионные свойства белка Mcm1. В то же время, эффектысверхпродукции Sfp1 могут быть обусловлены прионными свойствами белка или еговзаимодействием с агрегатами [PSI+], так как мы показали, что Sfp1 можетформировать детергент-устойчивые агрегаты и частично колокализуется с агрегатамиSup35.
Таким образом, не исключено, что Sfp1 влияет на [PSI+] через два не связанныхмежду собой механизма.17Рисунок 10. Влияние CUR1 на прионы компенсируется коэкспрессией SIS1. А.Флуоресцентная микроскопия клеток ОТ56, сверхэкспрессирующих указанные аллели CUR1и SIS1, после инкубации с DMSO или MG132.
Б. Оценка среднего числа клеток из панели Адля четырёх полей зрения с преимущественно ядерной локализацией Sis1. Планкипогрешностей обозначают доверительные интервалы, рассчитанные по t-критериюСтьюдента (уровень значимости 0,05). В. Из штаммов 2-OT56, экспресирующих указанныеконструкции, после инкубации с DMSO или MG132 выделяли белковые лизаты ианализировали с помощью вестерн-блот гибридизации с антителами к GFP.Важным результатом является обнаружение способности Sis1 компенсироватьприонную токсичность [PSI+], не приводя к потере приона. Известно, чтосверхпродукция Sis1 также компенсирует токсичность другого приона, [PIN+], итоксичность, вызываемую у дрожжей хантингтином человека (polyQ-токсичность).
Всовокупности эти данные указывают на то, что Sis1 может противодействоватьтоксичным эффектам присутствия в клетке различных амилоидов, что можноиспользовать в исследованиях амилоидозов.Мы проанализировали влияние различных шаперонов и факторов их сортинга ипоказали, что сверхэкспрессия CUR1, HSP42 и YDJ1 приводит к усилению приона[PSI+] (и, как следствие, к усилению синтетической летальности), а также кослаблению и потере приона [URE3]. Мы установили, что влияние Сur1 на прионывызвано его способностью изменять локализацию шаперона Sis1 на преимущественноядерную, что по-разному воздействует на силу и стабильность [PSI+] и [URE3].181.2.3.4.5.6.7.8.ВыводыУстановлено влияние белков, кодируемых генами TEF2, MCM1, и HLJ1, насинтетическую летальность приона [PSI+] с мутациями sup45.Естественные супрессорные тРНК могут кодон-специфично влиять насинтетическую летальность, что продемонстрировано на примере тРНКTrp.Ген TEF2, кодирующий фактор элонгации трансляции eEF1A, являетсямультикопийным аллосупрессором как фактора [PSI+], так и мутаций sup45.Транскрипционная регуляция генов, кодирующих факторы терминации трансляции,может влиять на эффективность нонсенс-супрессии в присутствии [PSI+], чтопоказано на примере влияния белков Sfp1 и Mcm1.Одним из эффектов, приводящих к повышению синтетической летальности,является усиление токсичности приона [PSI+], которое может возникать вследствиеувеличения транскрипции гена SUP35.Шаперон Hsp40-Sis1 ослабляет прионную токсичность [PSI+].Влияние гена CUR1 на свойства прионов [PSI+] и [URE3] связано с влияниемкодируемого им белка на ядерный импорт шаперона Sis1.N-концевойрайонбелкаCur1важендляегодеградациипоубиквитин-протеасомному механизму.Публикации по теме диссертации в журналах, рекомендованных ВАК:1.
Матвеенко А.Г., Землянко О.М., Журавлева Г.А. Идентификация геновSaccharomyces cerevisiae, влияющих на синтетическую летальность приона [PSI+] смутациями в гене SUP45 // Молекулярная биология. – 2013. – т. 47, № 4. – с.609-617.2. Drozdova P.B., Tarasov O.V., Matveenko A.G., Radchenko E.A., Sopova J.V., PolevD.E., Inge-Vechtomov S.G., Dobrynin P.V.
Genome sequencing and comparative analysisof Saccharomyces cerevisiae strains of the Peterhof genetic collection // PloS ONE. –2016. – Vol. 11, № 5. – e0154722.3. Мaтвеенкo A.Г., Белoyсoв M.B., Бoндapeв C.A., Moскaлeнкo C.Е., Жypaвлeва Г.A.Идентификaция новых генoв, влияющиx нa тoксичность пpиoнa [PSI+] y дpoжжeйSаcchаromуces cеrevisiаe // Молекулярная биология. – 2016. – т. 50, № 5.– с.
803-813.4. Matveenko A.G., Drozdova P.B., Belousov M.V., Moskalenko S.E., Bondarev S.A.,Barbitoff Y.A., Nizhnikov A.A., Zhouravleva G.A. SFP1-mediated prion-dependentlethality is caused by increased Sup35 aggregation and alleviated by Sis1 // Genes to cells.– 2016. – Vol. 21, №12. – p. 1290-1308.Тезисы конференций:1. Матвеенко А.Г., Землянко О.М., Журавлева Г.А. Поиск генов, влияющих нанесовместимость мутаций в гене SUP45 с прионом [PSI+] у Saccharomyces cerevisiae.XVI Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология –наука XXI века» 16 – 21 апреля 2012, Пущино, с. 129-130.2.
Matveenko A.G., Zemlyanko O.M., Pashkovskaja N.A., Zhouravleva G.A. Theidentification of genes leading to synthetic lethality of prion [PSI+] with sup45 mutations.Abstracts of the International Conference “Protein misfolding in disease: molecularprocesses and translational research toward therapy”. Roscoff (France), 13-17 April 2013.193.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
