Автореферат (1145680), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Стрелкивверх/вниз обозначают усиление/ослабление, количество стрелок соответствует степенивыраженности эффекта; Н.о. – эффект невозможно оценить из-за сильного сниженияскорости роста.10Исходно мы использовали аллель SFP1-fs636, содержащую сдвиг рамкисчитывания в 636-м кодоне, который приводит к последующему появлениюстоп-кодона и синтезу укороченного белка. Сверхэкспрессия аллели SFP1 дикого типавызывала ещё более выраженное снижение жизнеспособности гибридов (Табл. 2).Мы сверхэкспрессировали те же гены в штаммах OT55 и OT56, несущих слабыйи сильный варианты [PSI+] соответственно, и проверили их влияние нанонсенс-супрессию и жизнеспособность штаммов. Сверхэкспрессия MCM1 иSFP1-fs636 наиболее сильно увеличивала супрессорный эффект как сильного, так ислабого вариантов [PSI+] (Табл.
2). Экспрессия ABF1, FKH2 и REB1 значительноснижала скорость роста и жизнеспособность штаммов, причём как [PSI+], так и [psi-].Для того чтобы убедиться, что аллосупрессия [PSI+] вызвана регуляциейтранскрипции со стороны Sfp1 и Mcm1, мы провели количественный анализ мРНКгенов SUP35 и SUP45, кодирующих факторы терминации трансляции. Оказалось, чтоАБРисунок 4.
Влияние SFP1 на экспрессию генов, кодирующих факторы терминациитрансляции. А. Результаты количественной ОТ-ПЦРРВ при сверхэкспрессии SFP1-fs636,MCM1, GLN3 и MOT3. Б. Вестерн-блот с детекцией Sup35, Sup45 и Tub1 и результатыденситометрии пяти независимых измерений уровней Sup35 и Sup45 относительно Tub1.11сверхэкспрессия МСМ1 усиливает транскрипцию SUP35, но не влияет на SUP45, аSFP1-fs636 увеличивает экспрессию обоих генов (Рис.
4А). Тем не менее,сверхэкспрессия аллели SFP1 дикого типа приводила к более выраженномуувеличению количества белка Sup35, чем Sup45 (Рис. 4Б). Мы также провериливлияние сверхэкспрессии GLN3 и MOT3 на уровни мРНК и белков факторовтерминации трансляции. Индукция экспрессии генов GLN3 и MOT3 добавлениемионов меди приводила к небольшому увеличению уровня экспрессии гена SUP35 (Рис.4А). Поскольку мы не наблюдали усиления супрессии при сверхэкспрессии GLN3 иMOT3, влияние этих факторов на синтетическую летальность, по-видимому, связано сусилением токсичности [PSI+], которое может быть вызвано усилением транскрипцииSUP35.Мы более подробно изучили влияние SFP1 на прион [PSI+].
Выяснилось, чтосверхпродукция полноразмерного белка Sfp1, но не его укороченного варианта(продукта гена SFP1-fs636), приводит к прион-зависимой летальности (Рис. 5А). Мыпоказали, что сверхэкспрессия SFP1 приводит к увеличению количестваагрегированного Sup35, что, по-видимому, связано с увеличением содержания Sup35 вклетках. Известно, что токсичность [PSI+] компенсируется сверхэкспрессией SUP45(Derkatch et al., 1998), однако мы показали, что в случае, когда токсичность вызванасверхэкспрессией SFP1, этого не происходит.
Мы проверили влияние шаперонов,участвующих в поддержании [PSI+], и выяснили, что токсичность [PSI+]компенсируется коэкспрессией Sis1, причём как в случае её возникновения присверхэкспрессии SFP1 (Рис. 5Б), так и в случае прямого увеличения экспрессии SUP35путём внедрения дополнительных копий гена.АБРисунок 5. SFP1 приводит к [PSI+]-зависимой летальности, которая компенсируетсясверхпродукцией Sis1.
А. Сверхэкспрессия SFP1 и SFP1-fs636 в OT56 ([PSI+]S) и 2-OT56([psi-]). Б. Коэкспрессия SFP1 с генами шаперонов SIS1 и HSP104 c мультикопийных векторовв штамме OT56. Представлены серии 10-кратных разведений.12С помощью полуденатурирующего электрофореза белков в агарозном геле мыпоказали, что Sfp1 может формировать детергент-устойчивые агрегаты (Рис. 6А).Индуцированная сверхпродукция Sfp1 также приводила к увеличению размеровагрегатов [PSI+], а коэкспрессия Sis1 возвращала распределение по размеру агрегатов висходное состояние. Более того, Sfp1 частично колокализовался как с Sis1, так и сSup35 в штамме [PSI+] (Рис.
6Б). Однако, сверхпродукция Sfp1 в штамме [psi–] неприводила к изменению диффузного характера флуоресценции как Sup35NM-GFP, таки Sup35N-GFP-MC, что говорит о том, что, по-видимому, мономерная форма Sup35 неспособна напрямую взаимодействовать с агрегатами Sfp1 in vivo, в то время какобратный процесс (вовлечение Sfp1 в агрегаты [PSI+]) может иметь место. Такимобразом, взаимодействие детергент-устойчивых агрегатов Sfp1 c агрегатами [PSI+]может являться дополнительным механизмом, приводящим к прионной токсичности[PSI+] при сверхпродукции Sfp1.АБРисунок 6.
Sfp1 формирует детергент-устойчивые агрегаты, которые могутколокализоваться с агрегатами [PSI+]. А. Анализ белковых лизатов клеток ОТ56 ([PSI+]) и2-OT56 ([psi-]), сверхэкспрессирующих указанные гены, с помощью SDD-AGE. Пробыинкубировали при 25 °C (Н) или 100 °C (К) перед нанесением. Иммуноблоттинг сиспользованием антител к GFP (верхняя панель) или Sup35 (нижняя панель). Б. Sfp1частично колокализуется с Sis1 и с Sup35. Флуоресцентная микроскопия клеток OT56,экспрессирующих указанные конструкции. ↑↑ – конститутивная сверхэкспрессия, ↑ –экспрессия под контролем индуцируемого промотора CUP1.Влияние Hlj1, Cur1 и других шаперонов на синтетическую летальностьГен HLJ1, кодирующий ЭПР-ассоциированный шаперон семейства Hsp40,присутствовал на двух плазмидах геномной библиотеки, усиливавших синтетическуюлетальность, и его сверхэкспрессия приводила к такому же результату.
Pанее былпоказан аналогичный эффект сверхэкспрессии гена CUR1, который кодирует фактор13сортинга, участвующий в транспорте белков-шаперонов между компартментамиконтроля укладки белков (PQC) (Malinovska et al., 2012). Мы изучили влияние Btn2,паралога Cur1, который также участвует в релокализации шаперонов. Оказалось, что,подобно CUR1, сверхэкспрессия BTN2 усиливает синтетическую летальность.Ранее в нашей лаборатории уже было обнаружено влияние некоторых шапероновсемейств Hsp100 и Hsp70 на синтетическую летальность (Киктев, 2008; Киктев и др.,2011).
Мы проанализировали влияние сверхэкспрессии генов шаперонов насинтетическую летальность (Табл. 3). Известно, что сверхэкспрессия как CUR1, так иBTN2 приводит к изгнанию приона [URE3] (Kryndushkin et al., 2008); кроме того, мыпоказали, что сверхэкспрессия CUR1 приводит к усилению супрессорного фенотипаприона [PSI+]. Поэтому мы также проверили влияние сверхпродукции различныхшаперонов на поддержание и проявление прионов [PSI+] и [URE3].
Сводныерезультаты этих экспериментов представлены в таблице 3.Таблица 3. Влияние шаперонов на синтетическую летальность, а также на поддержание ипроявление прионов [PSI+] и [URE3].ГенШаперонСинтетическаялетальность[PSI+][URE3]HSP104Hsp100↓↓↓↓↓↓–SSB1Hsp70(RAC)↓↓↓↓?SSB2Hsp70(RAC)↓↓↓↓?SSA1Hsp70↑↑↑–SSA2Hsp70↑↑–↓SSA3Hsp70–––SSA4Hsp70↓↓↓–CUR1ф-р сортинга↑↑↑↑↑↓↓↓BTN2ф-р сортинга↑↑–↓↓↓SIS1Hsp40↓↓––YDJ1Hsp40↑↑↑↑↑↓↓↓HLJ1Hsp40↑↑–?HSP26sHsp↑↑––HSP42sHsp↑↑↑↑/–*↓↓↓вектор––––Левый столбец: результаты скрещивания OT56, трансформированного плазмидами длясверхэкспрессии указанных генов, со штаммами 1A-D1628, несущими указанные мутацииsup45. Стрелки вверх/вниз обозначают усиление/ослабление, количество стрелоксоответствует степени выраженности эффекта; ? – эффект не анализировался.
RAC –комплекс, ассоциированый с рибосомой. * – наблюдалось усиление сильного [PSI+]S, но неслабого варианта [PSI+]W.14Известно, что в составе белка Cur1 есть функциональная последовательностьсигнала ядерной локализации (NLS) (Malinovska et al., 2012), однако других данных оструктуре белка нет. Для того, чтобы определить возможные функциональные доменыбелка, мы провели делеционный анализ гена CUR1. Нами была сконструирована серияплазмид для сверхэкспрессии аллелей CUR1 с различными делециями. Оказалось, чтоделеция N-концевого участка, не затрагивающая NLS (с 3-й по 22-ю аминокислоты),приводит к усилению влияния Cur1 как на синтетическую летальность, так и насупрессию [PSI+] и изгнание [URE3].
Все остальные делеции приводили к тому, чтоэти эффекты исчезали или, в случае делеции с 3-й по 30-ю аминокислоты,включавшей и NLS, становились заметно слабее (Рис. 7).Рисунок 7. Делеционный анализ гена CUR1. Штаммы OT55, OT56 и ОТ520 (BY241) былитрансформированы плазмидами для сверхэкспрессии делеционных вариантов CUR1.Трансформантов анализировали с помощью серий пятикратных разведений на селективныхсредах.Известно, что Cur1 функционально взаимодействует с Sis1 и влияет на еговнутриклеточную локализацию (Malinovska et al., 2012).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
