Автореферат (1145680), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Для переноса белков из агарозного геля намембрану PVDF использовали капиллярный перенос (Alberti et al., 2010).Выделение белков из дрожжей проводили по методу щелочного лизиса (Kushnirov,2000; Zhang et al., 2011) либо по стандартной методике (Chabelskaya et al., 2004).Выделение плазмидной ДНК из дрожжей и бактерий, гель-электрофорезы белков иДНК, вестерн-блот гибридизацию, молекулярное клонирование и конструированиеплазмидных векторов проводили по стандартным методикам.OT-ПЦРРВ, флуоресцентную конфокальную микроскопию и секвенированиепоследовательностей плазмид осуществляли в Ресурсном центре «Развитиемолекулярных и клеточных технологий».6РезультатыСкрининг геномной библиотеки, направленный на выявление новыхфакторов, влияющих на терминацию трансляцииВ данной работе был проведён поиск новых факторов, влияющих либо на [PSI+],либо на аппарат трансляции, и исследованы возможные механизмы, которые лежат воснове влияния некоторых выявленных кандидатов.
Ранее было показано, чтоодновременное присутствие в клетке фактора [PSI+] и мутаций в гене SUP45 можетоказаться летальным для дрожжей. Это явление получило название синтетическойлетальности [PSI+] с мутациями sup45 (далее – синтетическая летальность), и на егооснове в нашей лаборатории была разработана и применена тест-системасинтетической летальности [PSI+] с мутациями sup45 (далее – тест-система). Втест-системе мы использовали штаммы, несущие нонсенс- и миссенс-мутации в генеSUP45, часть из которых (sup45-101, -102, -104, -105, 107, -116) летальны прискрещивании со штаммом, несущим сильный вариант [PSI+], в то время как мутацииsup45-113 и sup45-115 не приводят к летальности (Kiktev et al., 2007) (Рис. 1).Рисунок 1.
Тест-система синтетической летальности и свойства использованных вработе мутаций sup45. Слева направо: показан характер роста гибридов при скрещиванииштаммов, производных 74-D694 (статус приона [PSI+] указан сверху), со штаммами1А-D1628, несущими указанные аллели SUP45; далее, рост штаммов 1A-D1628 [sup45-x] насреде для цветной селекции (¼YEPD) и среде без аденина; справа – характеристика мутацийв гене SUP45 и продуцируемых вариантов белка Sup45 у мутантов.
Пунктирной стрелкойобозначен полноразмерный белок, который в малых количествах продуцируется унонсенс-мутантов (см. Москаленко, 2003).Данная тест-система была использована для проведения скрининга библиотекигенов S. cerevisiae, находящихся на мультикопийных плазмидах (Киктев и др., 2011).По результам скрининга ранее уже были идентифицированы некоторые гены,продукты которых влияют на синтетическую летальность. Эти гены, а также гены,идентифицированные в данной работе, приведены в таблице 1.Нами было проанализировано 15 конструкций из библиотеки генов.
В результатебыло отобрано 10 плазмид: присутствие девяти из них усиливало синтетическуюлетальность, а одной – снижало. Концевые последовательности вставок геномнойДНК были идентифицированы с помощью секвенирования. Поиск полученныхпоследовательностей в базе данных генома S. cerevisiae (www.yeastgenome.org)7позволил определить присутствующие на плазмидах фрагменты хромосом исодержащиеся в них гены.Таблица 1. Гены, обнаруженные при скрининге сверхэкспрессионной геномной библиотеки.ГенHSP104RNQ1CCUR1HLJ1MCM1TEF2tW(CCA)G1Функция продуктаHsp100, дезагрегаза? (нуклеация приформировании прионов)Cортинг шапероновHsp40, ассоциированный смембраной ЭПРТранскрипционный факторФактор элонгациитрансляции eEF1AТриптофановая тРНКСинтетическаялетальность*↓СсылкаКиктев и др., 2011↓Киктев и др., 2011↑Киктев и др., 2011↑Матвеенко и др., 2013↑Матвеенко и др., 2013↑Матвеенко и др., 2013↓Матвеенко и др., 2013;данная работа*Стрелки вверх/вниз обозначают усиление/ослабление синтетической летальности.В дальнейшей работе мы более подробно изучили влияние на синтетическуюлетальность генов tW(CCA)-G1, TEF2, MCM1, HLJ1 и CUR1.
Мы обратили вниманиена ген HLJ1, так как сразу две плазмиды содержали один и тот же участок хромосомыXIII, несущий ген HLJ1. Также две плазмиды содержали последовательность генаMCM1. Ген CUR1 был выявлен ранее (Киктев и др., 2011).СверхэкспрессияестественнойсупрессорнойтРНКTrpослабляетсинтетическую летальностьНа фрагменте хромосомы, идентифицированном в составе одной из плазмидгеномной библиотеки (YEp13-184-2) был обнаружен ген tW(CCA)-G1, кодирующийтриптофановую тРНК. Эта конструкция единственная из обнаруженных приводила кснижению синтетической летальности, причём выраженность эффекта быланеодинакова при скрещиваниях с разными мутантами sup45.
Ген tW(CCA)-G1 былпереклонированвмультикопийныйвекторpRS425.ТрансформантыpRS425-tW(CCA)-G1, также как и YEp13-184-2, демонстрировали аналогичноеснижение синтетической летальности, более выраженное при скрещивании сРисунок 2. Снижение синтетической летальностивызвано сверхэкспрессиейtW(CCA)-G1.Штаммы+ SOT56 ([PSI ] ) и 2-OT56([psi–]) были трансформированы указанными плазмидами;трансформантованализироваливтестсистеме (скрещивали соштаммами 1A-D1628, несущими указанные аллели SUP45) и оценивали рост на средах, несодержащих аденин (показан рост штамма OT56 после 2-х дней, а 2-OT56 – после 7-ми днейинкубации) или триптофан (21 день инкубации).8мутантами sup45-107 (UGA), чем с sup45-105 (UAA) (Рис.
2). Кроме того, присутствиеобеих плазмид одинаково усиливало супрессию ade1-14 (UGA) как в [PSI+], так и в[psi–] штаммах, но не приводило к супрессии trp1-289 (UAG) (Рис. 2). Полученныерезультаты согласуются с тем, что тРНКTrp может являться естественно-супрессорнойдля нонсенс-кодона UGA, но не для UAA и UAG. Таким образом, обнаруженное вданной работе уменьшение синтетической летальности обусловлено сверхэкспрессиейгена естественной супрессорной тРНКTrp.Влияние гена TEF2 и других факторов элонгации трансляции насинтетическую летальность и нонсенс-супрессиюОдна из плазмид геномной библиотеки содержала ген TEF2, который, как и егопаралог TEF1, кодирует фактор элонгации трансляции eEF1A.
Известно, что TEF2влияет на эффективность терминации трансляции, что проявляется в том числе какснижение уровня нонсенс-супрессии при инактивации одного из генов TEF1 или TEF2(Song et al., 1989). Мы проанализировали в тест-системе мультикопийный векторYEplac181-TEF2, а также аналогичные конструкции для сверхэкспрессии другихфакторов элонгации трансляции. Оказалось, что введение дополнительных копий генаTEF2 действительно усиливает синтетическую летальность (Рис. 3А). Другие факторыэлонгации приводили к едва заметному улучшению роста гибридов.
Одновременно,мы проверяли влияние тех же конструкций на нонсенс-супрессию в штамме [PSI+].Как и следовало ожидать, TEF2 усиливал супрессию, однако остальные факторыприводили к её заметному снижению (Рис. 3А, правая панель). Таким образом,антисупрессия, вызванная повышенной продукцией некоторых факторов элонгации,АБРисунок 3. Влияние генов, кодирующих факторы элонгации трансляции, насинтетическую летальность и нонсенс-супрессию.
А. Результаты скрещиваний штаммаОТ56 ([PSI+]S), трансформированного плазмидами для сверхэкспрессии TEF2, TEF3, TEF4или TEF5, со штаммами L-1A-D1628, несущими указанные аллели SUP45. Б. Штаммы1B-D1606 (SUP45), 113-1B-D1606 (sup45-113) и 115-1B-D1606 (sup45-115) трансформировалиплазмидами YEplac195-TEF2 или YEplac195 (контроль). Полученных трансформантовпроверяли по способности расти на указанных селективных средах.9слабо детектируется с помощью теста на синтетическую летальность, что необходимоучитывать при дальнейшем использовании теста.Сконцентрировавшись на изучении TEF2, мы предположили, что егосверхэкспрессия может приводить к усилению нонсенс-супрессии и у штаммов смутациями sup45.
Для проверки данной гипотезы мы сверхэкспрессировали TEF2 вмутантах sup45-113 и sup45-115. Действительно, штаммы с мутантными аллелямиsup45 в присутствии TEF2 росли лучше на средах для оценки супрессии (Рис. 3Б).Таким образом, мы показали, что TEF2, по-видимому, является универсальнымаллосупрессором, так как он усиливает супрессию как на фоне [PSI+], так и на фонемутаций sup45.Влияние генов Mcm1, Sfp1 и других Q/N-богатых транскрипционныхфакторов на синтетическую летальностьГен MCM1 кодирует жизненно-важный транскрипционный фактор, содержащийдомен MADS.
Кроме того, белок Mcm1 содержит Q-богатый С-терминальный домен ипотому является потенциально прионогенным. Cверхэкспрессия MCM1 под контролеминдуцибельного промотора CUP1 приводила к чёткому усилению синтетическойлетальности. Мы проверили, влияет ли экспрессия других Q/N-богатыхтранскрипционных факторов на синтетическую летальность. Оказалось, что наиболеевыраженный эффект проявляли гены GLN3, MOT3, MCM1 и SFP1 (Табл. 2).Таблица 2. Влияние Q/N-богатых транскрипционных факторов на синтетическуюлетальность и рост штаммов [PSI+]S и [psi-].ГенGFPСинтетическая Нонсенс-суплетальность рессия [PSI+]––Рост[PSI+]S–Рост[psi-]–ABF1Н.о.Н.о.↓↓↓↓CYC8––––FKH2Н.о.Н.о.↓↓↓↓↓GLN3↑↑–↓↓MCM1↑↑↑↑↓–MOT3↑↑–↓↓PGD1––––REB1Н.о.Н.о.↓↓↓↓↓SFP1↑↑↑–↓↓–SFP1-fs636↑↑↑––вектор––––Левый столбец: результаты скрещивания OT56, сверхэкспрессирующего гены с плазмидсерии pU, cо штаммами 1A-D1628, несущими указанные мутации sup45.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
