Диссертация (1145681), страница 11

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 11)

1997;Newnam et al. 1999)(Derkatch et al. 1997;Newnam et al. 1999)Matveenko et al., 2016Matveenko et al., 2016Moskalenko et al., 2003Moskalenko et al., 2003Moskalenko et al., 2003Kiktev et al., 2007Kiktev et al., 2007Moskalenko et al., 2003Moskalenko et al., 2003Moskalenko et al., 2003Kiktev et al., 2007Kiktev et al., 2007Таблица 3 (продолжение)ШтаммOT56-ckGT1959GT1947GT2050BY241/OT520BY241/OT519GT81-1CGT859GT1903-3B1B-D1606101-1B-D1606105-1B-D1606107-1B-D1606113-1B-D1606115-1B-D160633G-D373ГенотипMATaade1-14trp1-289his3-Δ200leu2-3,112 ura3-52 cur1::kanMX [PSI+]S[PIN+]MATaade1-14trp1-289his3Δ-200leu2-3,112 ura3-52 cur1::HIS3MX [PSI+]W[PIN+]MATaade1-14trp1-289his3-Δ200leu2-3,112 ura3-52 btn2::HIS3MX [PSI+]W[PIN+]MATaade1-14trp1-289his3-Δ200leu2-3,112ura3-52btn2::HIS3MXcur1::kanMX [PSI+]W [PIN+]MATa leu2 trp1 ura3 PDAL5ADE2 PDAL5CAN1kar1-1 [URE3-1] [PIN+]MATa leu2 trp1 ura3 PDAL5ADE2 PDAL5CAN1kar1-1 [ure-0] [PIN+]MATa ade1-14 his3 leu2 lys2 trp1-289 ura3[PSI+]S [PIN+]MATa ade1-14 his3 leu2 lys2 trp1-289 ura3hsp42::HIS3MX [PSI+]S [PIN+]MATa ade1-14 his3 leu2 lys2 trp1-289 ura3SIS1-GFP::kanMX [PSI+]S [PIN+]MATα ade1-14 his7-1 lys9-A21 trp1-289ura3-52 leu2–3,112MATα ade1-14 his7-1 lys9-A21 trp1-289ura3-52 leu2–3,112 sup45-101MATα ade1-14 his7-1 lys9-A21 trp1-289ura3-52 leu2–3,112 sup45-105MATα ade1-14 his7-1 lys9-A21 trp1-289ura3-52 leu2–3,112 sup45-107MATα ade1-14 his7-1 lys9-A21 trp1-289ura3-52 leu2–3,112 sup45-113MATα ade1-14 his7-1 lys9-A21 trp1-289ura3-52 leu2–3,112 sup45-115MATα pha2P-A10 ade2-144,717 his7-1lys9-A21 trp1-289 ura3-52 leu2-3,112СсылкаДанная работаДанная работаДанная работаДанная работаBrachmann et al., 2005Brachmann et al., 2005Chernoff et al., 2000Данная работаДанная работаMoskalenko et al., 2003Moskalenko et al., 2003Moskalenko et al., 2003Moskalenko et al., 2003Москаленко и др., 2004Москаленко и др., 2004Chernoff et al., 1988Для скрещиваний в тесте на синтетическую летальность использовалипроизводные штамма 1A-D1628 (MATα ade1-14(UGA) trp1-289(UAG) ura3-52 his3lys2 leu2-3,112 SUP45::HIS3 [pRS316-SUP45]), несущего дизрупцию гена SUP45 нахромосоме [Moskalenko et al., 2003].

Штаммы L-1A-D1628, 105L-1A-D1628,107L-1A-D1628, 113L-1A-D1628 и 115L-1A-D1628 несут аллель SUP45 дикого типа57(wt) или мутантные аллели, которые поддерживаются на центромерных плазмидахpRS315-SUP45,pRS315-sup45-105,pRS315-sup45-107,pRS315-sup45-113иpRS315-sup45-115, соответственно [Moskalenko et al., 2003; Москаленко и др., 2004].Рисунок 8.

Репортерная конструкция в штамме BY241 и фенотипический анализ статуса[URE3]. В верхней части - схема конструирования аллели PDAL5-ADE2 (по Brachmann et al., 2005).В нижней части: высевы серии 10-кратных разведений штаммов OT519 и OT520 на указанныесреды.ПлазмидыПлазмиды, использованные в данной работе, приведены в таблице 4. Дляэкспрессии SFP1 использовали центромерную плазмиду pU-SFP1 [Нижников и др.,2013 // Экологическая генетика] и мультикопийную pRS426-SFP1 (2μ, URA3, pSFP1)[Rogoza et al., 2010], которые несут ген под контролем промоторов pCUP1 и pSFP1,соответственно. В качестве контролей использовали плазмиды pRS316 [Sikorski &Hieter, 1989 // Genetics], pRS316CG [Serio et al., 1999 // METHODS INENZYMOLOGY] и pRS426 [Christianson et al., 1992].58Таблица 4.

Плазмиды, использованные в работе.ПлазмидаpU-SFP1pU-SFP1-fs636pU-SFP1ΔCpRS426-SFP1pRS425-SFP1pRS426pRS425pRS315pR15CUP-SFP1-CeruleanpR16CUP-SFP1-CeruleanpRS415GPD-CeruleanpRS316CGpRS315CmCpRS315CUP-SFP1-mCherrypmCUP-NM-GFPpUCNGMCpRSU2pRSU4pRS315-SUP45pRS315-sup45-101pRS315-sup45-105pRS315-sup45-107pRS315-sup45-113pRS425-SUP45pRS425-sup45-101pRS425-sup45-105pRS425-sup45-107pRS425-sup45-113pYX242-SUP35CpRS425-UPF1pRS426-UPF1YEp351pRS315pRS316pRS425pRS426pRS425-CUR1pRS426-CUR1pRS426-cur1Δ3-22pRS426-cur1Δ3-30pRS426-cur1Δ3-106pRS426-cur1Δ3-159ОписаниеCEN, URA3, pCUP1-SFP1CEN, URA3, pCUP1-SFP1-fs636(T1908Δ; F636L, S637A, V638[UAA])CEN, URA3, pCUP1-SFP1ΔC (T1908Δ,Δ1916-2052; F636L, S637A, Δ638-683)2μ, URA3, pSFP1-SFP12μ, LEU2, pSFP1-SFP12μ, URA32μ, LEU2CEN, LEU2CEN, LEU2, pCUP1-SFP1-CeruleanCEN, URA3, pCUP1-SFP1-CeruleanCEN, LEU2, pTDH3-CeruleanCEN, URA3, pCUP1-sGFPCEN, LEU2, pCUP1-mCherryCEN, LEU2, pCUP1-SFP1-mCherryCEN, URA3, pCUP1-SUP35NM-sGFPCEN, URA3,pCUP1-SUP35N-GFP-SUP35MCCEN, URA3, pSUP35-SUP352μ, URA3, pSUP35-SUP35CEN, LEU2, pSUP45-SUP45CEN, LEU2, pSUP45-sup45-101CEN, LEU2, pSUP45-sup45-105CEN, LEU2, pSUP45-sup45-107CEN, LEU2, pSUP45-sup45-1132μ, LEU2, pSUP45-SUP452μ, LEU2, pSUP45-sup45-1012μ, LEU2, pSUP45-sup45-1052μ, LEU2, pSUP45-sup45-1072μ, LEU2, pSUP45-sup45-1132μ, LEU2, pTPI1-SUP35C2μ, LEU2, pUPF1-UPF12μ, URA3, pUPF1-UPF12μ, LEU2CEN, LEU2CEN, URA32μ, LEU22μ, URA32μ, LEU2, pCUR1-CUR12μ, URA3, pCUR1-CUR12μ, URA3, pCUR1-cur1Δ3-222μ, URA3, pCUR1-cur1Δ3-302μ, URA3, pCUR1-cur1Δ3-1062μ, URA3, pCUR1-cur1Δ3-15959СсылкаMatveenko et al.

2016Matveenko et al. 2016Matveenko et al. 2016Rogoza et al. 2010Rogoza et al. 2010Christianson et al. 1992Christianson et al. 1992Sikorski and Hieter 1989Данная работаДанная работаP. Lipaeva, unpublishedSerio et al. 1999Matveenko et al. 2016Matveenko et al. 2016Serio et al. 1999K. Antonets, unpublishedVolkov et al. 2002Volkov et al. 2002Moskalenko et al. 2003Moskalenko et al. 2003Moskalenko et al. 2003Moskalenko et al.

2003D. Kiktev, unpublishedD. Kiktev, unpublishedD. Kiktev, unpublishedD. Kiktev, unpublishedD. Kiktev, unpublishedLe Goff et al. 2002Matveenko et al. 2016Matveenko et al. 2016Hill et al. 1986Sikorski and Hieter, 1989Sikorski and Hieter, 1989Christianson et al., 1992Christianson et al., 1992Kiktev et al., 2011Данная работаДанная работаДанная работаДанная работаДанная работаpRS426-cur1Δ109-252pRS426-cur1Δ162-204pRS426-CUR1-mCherrypRS426-cur1Δ3-22-mCherrypRS426-CUR1-EYFPpRS426-cur1Δ3-22-EYFPpRS426-cur1Δ162-204-EYFPp426-GPD-YFPpAG416GPD-Btn2pAG416GPD-Cur1-EGFPpAG415ADH1-Sis1-EGFPpAG415GPD-Sis1-mCherrypAG415GPD-Sis1-HApAG415GPD-Hsp42pAG415GPD-Hsp42-mCherrypAG415GPD-Hsp26-mCherrypAG415GPD-Cur1-EGFPpAG415GPD-Btn2-EGFPpCUP-SUP35NM-His6pTEF-SSA1pTEF-SSA3pTEF-SSA4pLH101pRS425-SSA2YEp-SSB1YEp-SSB2YEp351-SIS1pRS315-Sis1YEplac195-TEF2YEplac181-YDJ1YEplac181-HSP104pYSGal104pRS316GALGAL-GFPpRS316GAL-SUP35NpRS316GAL-SUP35NM-GFPCEN-GAL-SUP35-RFPCENGALSUP35 (=pVK71)2μ, URA3, pCUR1-cur1Δ109-2522μ, URA3, pCUR1-cur1Δ162-2042μ, URA3, pCUR1-CUR1-mCherry2μ, URA3, pCUR1-cur1Δ3-22-mCherry2μ, URA3, pCUR1-CUR1-EYFP2μ, URA3, pCUR1-cur1Δ3-22-EYFP2μ, URA3, pCUR1-cur1Δ162-204-EYFP2μ, URA3, pTDH3-EYFPCEN, URA3, pTDH3-BTN2CEN, URA3, pTDH3-CUR1-EGFPCEN, LEU2, pADH1-SIS1-EGFPCEN, LEU2, pTDH3-SIS1-mCherryCEN, LEU2, pTDH3-SIS1-HACEN, LEU2, pTDH3-HSP42CEN, LEU2, pTDH3-HSP42-mCherryCEN, LEU2, pTDH3-HSP26-mCherryCEN, LEU2, pTDH3-CUR1-EGFPCEN, LEU2, pTDH3-BTN2-EGFPCEN, LEU2, pCUP1-SUP35NM-His6CEN, URA3, pTEF1-His6-Expr-SSA1CEN, URA3, pTEF1-SSA3CEN, URA3, pTEF1-SSA42μ, LEU2, pSSA1-SSA12μ, LEU2, pSSA2-SSA22μ, URA3, pSSB1-SSB12μ, URA3, pSSB2-SSB22μ, LEU2, pSIS1-SIS1CEN, LEU2, pSIS1-SIS12μ, URA3, pTEF2-TEF22μ, LEU2, pYDJ1-YDJ12μ, LEU2, pHSP104-HSP104CEN, URA3, pGAL1,10-HSP104CEN, URA3, pGAL1,10CEN, URA3, pGAL1,10-EGFPCEN, URA3, pGAL1,10-SUP35NCEN, URA3, pGAL1,10-SUP35NM-GFPCEN, URA3,pGAL1,10-SUP35ΔS(Δ484-685)-DsRed2CEN, URA3, pGAL1,10-SUP35Данная работаДанная работаДанная работаДанная работаДанная работаДанная работаДанная работаP.

Lipaeva, unpublishedMalinovska et al., 2012Malinovska et al., 2012Malinovska et al., 2012Malinovska et al., 2012Malinovska et al., 2012Malinovska et al., 2012Malinovska et al., 2012Malinovska et al., 2012Malinovska et al., 2012Malinovska et al., 2012Kiktev et al., 2015James et al., 1997Allen et al., 2005Allen et al., 2005Newnam et al., 1999Matveenko et al. 2016Gautschi et al., 2002Gautschi et al., 2002Matveenko et al., 2016Gokhale et al., 2005Valouev et al., 2002Kushnirov et al., 2000Urakov et al., 2010Lindquist and Kim, 1996Liu et al., 1992Chernoff et al., unpublishedBailleul et al. 1999Chernoff et al., unpublishedBorchsenius et al., 2006Derkatch et al., 1996Секвенирование концевых районов вставок плазмид библиотеки геновосуществляли на коммерческой основе в ООО «Синтол» (г.

Москва) с праймеров 175и 176.ДлявизуализациииспользовалиплазмидыSfp1спомощьюpU-SFP1-GFP60ифлуоресцентноймикроскопииpRS415GPD-SFP1-Cerulean.Дляконструирования pU-SFP1-GFP из плазмиды pU-VTS1-GFP [Nizhnikov et al., 2012 //Curr. Genet.] с помощью BamHI и SacII была вырезана последовательность гена VTS1,на место которой лигирована рамка считывания SFP1, амплифицированная спомощью ПЦР на матрице pU-SFP1 с праймеров FSFP1BGL2 и RSFP1SAC2(Таблица 5) и рестрицированная BglII и SacII. Плазмида pRS415GPD-SFP1-Cerulean[Липаева П.В., не опубликовано] кодирует Sfp1, слитый с mCerulean, под контролемконститутивного промотора pGPD (pTDH3).

В качестве контроля использовалиплазмидуpRS415GPD-Cerulean.ОбеплазмидысконструированыpAG415GPD-ccdB-Cerulean (Plasmid #14386, Addgene)наоснове[Липаева П.В., неопубликовано].Последовательности сконструированных векторов были проверены секвенированием.еквенирование плазмид проводили сотрудники Ресурсного центра СПбГУ “Развитиемолекулярных и клеточных технологий».Среды и методы культивированияВ работе применяли стандартные методы культивирования микроорганизмов[Kaiser et al., 1994]. Для амплификации плазмид использовали штамм Escherichia coliDH5α [Hanahan, 1985].

Бактерий культивировали при 37 °С на твёрдой и жидкойсредах LB с добавлением ампициллина до концентрации 100 мкг/мл. Для сине-белойселекции в среду добавляли X-gal и IPTG (Sambrook et al., 1989). Дрожжи культивировали при30 °С на твёрдой и в жидкой полной среде YEPD и на селективных средах на основеYNB (Invitrogen), содержащих необходимые добавки [Захаров и др., 1984; Sherman etal., 1986]. Для индукции промотора pCUP1 в среду добавляли 150 мкМ CuSO4.Трансформацию дрожжей плазмидной ДНК проводили по методу [Gietz et al., 2006].Таблица 5.

Характеристики

Список файлов диссертации