Диссертация (1145681), страница 9
Текст из файла (страница 9)
[PSI+][PSI+] был обнаружен при исследовании нонсенс-супрессии, как фактор,усиливающий действие слабого ochre (UAA) супрессора SUQ5 (Cox, 1965). Вдальнейшем, как оказалось, этот детерминант сам является омнипотентнымсупрессором (Liebman & Sherman, 1979) и способен вызвать супрессию, даже приполномотсутствиидругихагентов(Coxetal.,1988).Первыефакты,устанавливающие связь между геном SUP35 и детерминантом [PSI+], были полученыв лаборатории физиологической генетики СПбГУ в 1993 году.
Было обнаружено, чтоамплификацияаллелидикоготипагенаSUP35вызываетиндукциюнонсенс-супрессорного фенотипа, который в некоторых случаях не исчезал послепотери плазмиды и наследовался цитоплазматически (Chernoff et al. 1993). При этомэффект супрессии элиминировался при выращивании дрожжей на среде с ГГХ(гидрохлоридом гуанидина), что было показано и для фактора [PSI+].
Из этого былсделан вывод, что сверхэкспрессия гена SUP35 приводит к индукции фактора [PSI+](Chernoff et al. 1993). В 1994 году была высказана гипотеза о том, что [PSI+]представляет собой прионную форму Sup35 (Wickner, 1994). Она позволилаобъяснить связь [PSI+] и Sup35, а также объяснить механизм нонсенс-супрессии[PSI+], который связан с тем, что Sup35 неспособен в полной мере выполнятьфкнуции фактора терминации трансляции в прионной форме (Рис.
4). Делеционныйанализ гена SUP35 позволил показать, что именно N–домен Sup35 отвечает заподдержание [PSI+]: делеция этого домена приводит к элиминации [PSI+] (TerAvanesyan et al. 1994). При этом N-домен Sup35 не только необходим, но идостаточен для поддержания [PSI+]. Частота возникновения [PSI+] de novo в клетках[psi-] повышается при сверхэкспрессии укороченной с 3’-конца аллели SUP35(Chernoff et al. 1993;Derkatch et al. 1996). При сверхэкспрессии укороченного Sup35,в состав которого входят только N и М домены, эта частота повышается, посравнению со сверхэкспрессией полноразмерного гена,в 18 раз, а присверэкспрессии только N домена она возрастает до 20000 раз (Kochneva-Pervukhova42et al.
1998). Таким образом, именно N-домен Sup35 отвечает за его прионныесвойства.Рисунок 4. [PSI+] приводит к возникновению нонсенс-супрессии. По Partridge & Barton, 2000.[PSI+] характеризуется большим разнообразием прионных штаммов иливариантов. Варианты [PSI+], обладающие высокой митотической стабильностью, иобеспечивающие выраженную супрессию нонсенс мутаций, называют сильными([PSI+]S, s - «strong»). Варианты [PSI+] с невысокой митотической стабильностью инезначительным уровнем супрессии называют слабыми ([PSI+]W, w - «weak»).Варианты [PSI+] стабильно поддерживаются in vivo и зависят от структурыамилоидов. Различные мутации в прионном домене приводят к формированиювариантов, различных по устойчивости и силе фенотипического проявления (King,432001).
Также метод трансформации клеток с помощью амилоидных фибрилл,полученных in vitro (King & Diaz-Avalos, 2004; Tanaka et al., 2004), позволилпродемонстрировать, что инфицирование клеток амилоидами, образованными при4oС, приводит к возникновению преимущественно сильных вариантов [PSI+], аинфицирование клеток амилоидами, образованными при 25o С или 37o С приводит квозникновению преимущественно слабых вариантов [PSI+] (Tanaka et al., 2004). Этии другие данные указывают на то, что разнообразие вариантов [PSI+] обусловленоконформационными различиями их прионных полимеров (Baxa et al., 2006).В поддержании [PSI+] задействованы все основные классы шапероновдрожжей.
Необходимый для поддержания большинства дрожжевых прионов белокHsp104 приводит к исчезновению [PSI+] как при делеции соответствующего гена, таки при его сверхэкспрессии (Chernoff et al., 1995). Сверхпродукция Ssa1 препятствуетисчезновению [PSI+] при сверхэкспрессии Hsp104 и усиливает индукцию [PSI+] denovo. Схожим образом на [PSI+] влияет и сверхэкспрессия SSA2, SSA3 и SSA4 (Allen etal., 2005). Шапероны Ssb1 и Ssb2 выступают в роли антагонистов шаперонов Ssa:ДелецияSSB1иSSB2ослабляетэффектизлечивания[PSI+],вызванныйсверхпродукцией Hsp104.
Кроме того, при сверхпродукции шаперонов Ssb1, Ssa1 иYdj1 наблюдали вариант-специфичное изгнание [PSI+], поддерживаемого химернымбелком, в котором N-домен Sup35 S. cerevisiae был заменен на аналогичный доменSup35 из P. methanolica (Kushnirov et al., 2000).Для возникновения [PSI+] de novo необходимо наличие так называемого Pin+фактора ([PSI+] inducibility). В качестве Pin+ может выступать сверхпродукция такихбелков, как Rnq1, Ure2, Swi1 и Cyc8, являющихся структурными для прионов [PIN+],[URE3+], [SWI+] и [OCT+], соответственно, а также, некоторых других белковсодержащих аспарагин и/или глутамин-богатые области (Derkatch et al., 2001).Наличие самих прионов [PIN+] и [SWI+] также позволяет индуцировать [PSI+] denovo (Derkatch et al., 2001; Du & Li, 2014).441.2.1.3.
[PIN+]/[RNQ1+]При изучении условий, влияющих на возникновение [PSI+] de novo послеизлечивания с помощью GuHCl или сверхэкспрессии HSP104, был обнаруженэпигенетический фактор, названный [PIN+] (PSI inducibility). Только штаммыфенотипа Pin+ способны переходить из состояния [psi–] в [PSI+] при сверхэкспрессииSUP35. Подобно [PSI+], Pin+-фактор также наследовался цитоплазматически,обратимо излечивался в присутствии GuHCl, не проявлялся на фоне делеции HSP104,однако его присутствие не зависело ни от [PSI+], ни от белка Sup35, что даваловозможность предположить, что [PIN+] является прионной формой другого белка(Derkatch et al., 1997).
Скрининг сверхэкспрессионной библиотеки на способностьприобретать фенотип Pin+ выявил 11 генов, часть из которых кодируютприоногенные белки (Derkatch et al., 2001). Параллельными исследованиями былопоказано, что химерный белок RMC, состоящий из С-концевого Q/N-богатого доменабелка Rnq1, связанного с МС-доменами Sup35, приводил, как и [PSI+], кнонсенс-супрессии (Sondheimer & Lindquist, 2000).
Выяснилось, что только делецияRNQ1 приводитк исчезновению Pin+-фактора, что указывает на то, что [PIN+]является прионной формой белка Rnq1.Белок Rnq1 (Rich in asparagine (N) & glutamine (Q)), содержит С-концевойQ/N-богатый прионный домен. Функции белка Rnq1 неизвестны, хотя есть данные ороли Rnq1 в регуляции клеточных делений при споруляции (Orlowska-Matuszewska& Wawrzycka, 2006).
Существует гипотеза, что главная функция Rnq1 состоит вусилении способности к агрегации у других белков, следствием которого являетсяповышение частот возникновения других прионов de novo. Таким образом, именноприонная форма Rnq1 может являться функциональной, что делает [PIN+]функциональным прионом.1.2.1.4. [URE3][URE3] представляет собой прионную форму белка Ure2 (Wickner, 1994). В45Ure2 выделяют Q/N-богатый домен, расположенный в районе 1-89 ак.; при этомпоказано, что район 1-65 ак. достаточен для индукции и поддержания приона [URE3].C-терминальный домен способен полностью компенсировать фенотипическиепроявления делеции гена URE2 (Masison et al., 1997).В норме белок Ure2 участвует в контроле ассимиляции азота, препятствуяимпорту в ядро транскрипционных активаторов Gln3 и Gat1 при наличии в средебогатых источников азота, таких как глутамин, аспарагин или аммоний, (Blinder et al.,1996; Cunningham et al., 2000).
При отсутствии богатых источников азота Gln3перестаёт взаимодействовать с Ure2 и транспортируется в ядро, где, вместе с Gat1,активирует транскрипцию генов, отвечающих за ассимиляцию бедных источниковазота (напр., уреидосукцината). Таким образом, мутации в URE2, как и появлениеприона [URE3], приводят к тому, что Gln3 постоянно присутствует в ядре внезависимости от источника азота, из-за чего система азотной репрессии оказываетсянефункциональной и дрожжи продолжают усваивать бедные источники азота приналичии в среде богатых (Рис 5, см.
Wickner et al., 2004).Рис. 5. Схема регуляции ассимиляции уреидосукцината (USA). ПоWickner et al., 2004.К генам, чья экспрессия жёстко регулируется системой Ure2-Gln3, относится в46том числе пермеаза аллантоевой кислоты Dal5, что было использовано дляконструирования специальных штаммов, используемых для фенотипической оценкиприонизации Ure2 на стандартных средах без необходимости использованияальтернативных источников азота (см. Рис. 8; Brachmann et al., 2005).1.2.1.5.
Прионные свойства Q/N-богатых транскрипционных факторовМножество данных об изменении транскрипции за счет формирующихамилоиды белков было получено для прионов S. cerevisiae. Список прионов, чьиприон-формирующие белки обладают активностью регуляторов транскрипции,включает в себя [URE3], [SWI+], [MOT3+] и [OCT+].Прион-формирующие белки соответствующих прионов играют различныероли в регуляции транскрипции. Ure2 - это компонент системы регуляции азотногокатаболизма,работающейчерезизменениелокализациитранскрипционногоактиватора GATA Gln3 (Blinder et al., 1996).
Swi1 является субъединицейхроматин-ремоделирующегокомплексаSWI/SNF,которыйнеобходимдлятранскрипции множества генов, включая гены, контролирующие метаболизм сахарови переключение типов спаривания (Saha et al., 2006). Mot3 - это репрессор иактиватор транскрипции, вовлеченный в регулирование спаривания, метаболизмуглерода, стрессовый ответ и контроль программы ремоделирования клеточнойстенкивходеадаптацииканаэробиозу(Grishinetal.,1998).Cyc8,прион-формирующий белок [OCT+], является компонентом комплекса Cyc8/Tup1,который подавляет транскрипцию более 150 генов (DeRisi et al., 1997, Smith et al.,2000). Интересно, что, в то время как Mot3 способствует рекрутированию комплексаCyc8/Tup1 для репрессии транскрипции, Cyc8/Tup1 вовлечен в рекрутированиекомплекса SWI/SNF для активации транскрипции (Proft et al., 2002).
Кроме того,детерминант [NSI+] (Saifitdinova et al., 2010, Nizhnikov et al., 2012), фенотип котороговызван одновременным присутствием прионов [SWI+] и [PIN+] (Nizhnikov et al., 2017),может немного изменять уровни мРНК нескольких генов (Nizhnikov et al., 2013,47Kondrashkina et al., 2014). Участие Swi1 в глобальной регуляции транскрипцииозначает, что скорее всего [SWI+] обладает гораздо большим числом ещё неустановленных фенотипических проявлений (Du et al., 2008). Например, [SWI+]также может проявляться в повышении устойчивости штамма к действиюбеномила – ингибитора сборки микротрубочек.
Похожие эффекты встречаются умутантов swi1 (Alberti et al., 2009)Наконец, Sfp1 является транскрипционным активатором генов, кодирующихбелки биогенеза рибосом и рибосомные белки (Marion et al., 2004; Jorgensen et al.2004). Несмотря на то, что прионный статус детерминанта [ISP+] представляетсясомнительным (см. Дроздова, 2016), Sfp1 содержит потенциальный прионный домен(Alberti et al., 2009) и агрегирует in vivo (Rogoza et al., 2010), а потому можетобладать прионными свойствами.1.2.2. Регуляция прионизации у дрожжей1.2.2.1.
Система клеточных шапероновИнфекционные амилоидные полимеры, в отличие от неинфекционных,расщепляются на олигомеры, которые в свою очередь способны присоединять иконвертировать новые мономеры белка. Именно способность к расщеплениюопределяет инфекционные свойства прионов, так как образующиеся олигомерызапускают новые раунды прионной репликации (Baxa 2008).
Для большинствадрожжевых прионов показано, что их агрегаты фрагментируются под контролемсистемы белков шаперонов.Значительный объём данных на сегодняшний день свидетельствует в пользутого, что за фрагментирование амилоидных прионов отвечает тот же аппарат, чтообеспечивает разборку неструктурированных белковых агрегатов, возникающих притепловом стрессе. В общем схема функционирования этого аппарата представляетсяследующим образом: Hsp40 (Sis1 или Ydj1) распознаёт амилоидный агрегат (Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
