Диссертация (1145681), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Разумно предположить, чтостимулируя это высвобождение, Rli1 может помочь в осуществлении дальнейшихсобытий терминации и рециклизации. Для обоих наборов факторов, eRF1 и eRF3, атакже Dom34 и Hbs1, существуют данные, показывающие, что eRF3 или Hbs1должныбытьспособныгидролизоватьГТФдлятого,чтобыпроизошларециклизация (Pisarev et al., 2010, Shoemaker et al., 2010; Pisareva et al., 2011;Shoemaker & Green, 2011).
Более того, вследствие гидролиза ГТФ этими факторами,их сродство к рибосомам уменьшается, и факторы легко изгоняются из комплекса(Shoemaker & Green, 2011). Эти данные соответствуют модели, в которой внормальных условиях комплекс eRF1 и eRF3 распознает стоп-кодоны, и гидролизГТФ с помощью eRF3 делает возможным уход ГДФ-формы фактора (Рис. 1).Определенный вариант расположения имеет место, когда конец фактора терминацииGGQ помещается в каталитический центр большой субъединицы. Катализируетсявысвобождение пептида, стимулируемое АТФ-независимой активностью Rli1.Наконец, гидролиз АТФ фактором Rli1 сопряжен с диссоциацией субъединиц.Разъединенные субъединицы затем связываются доступными факторами инициации,которые готовят их для дальнейших раундов инициации или реинициации (Pisarev et18al., 2007).Важную роль в терминации трансляции и рециклизации рибосомы играеттакже polyA-связывающий белок Pab1.
Показано, что он взаимодействует сN-доменом eRF3, а его сверхэкспрессия приводит к антисупрессии на фоне мутацийsup35, а также уменьшает прочитывание различных стоп-кодонов. Кроме того, Pab1стимулирует активность eRF3 в терминации трансляции (Cosson et al., 2002).Взаимодействие Pab1 с Sup35 важно для различных функций Pab1. У эукариот7-метилгуанозиновый кэп на 5’- и polyА на 3’-конце мРНК взаимодействуют сосвязывающим кэп фактором инициации eIF4E и PABP (гомолог Pab1 у Metazoa),соответственно.
За счёт непрямого взаимодействия этих двух белков черезпромежуточный белок eIF4G, мРНК формирует кольцевую структуру (Amrani et al.,2008). Более того, поскольку фактор терминации трансляции eRF3 и eIF4Gсвязываются, формируя комплекс, с PABP (Uchida et al., 2002), сайт терминациитрансляции может подойти близко к сайту инициации трансляции за счетвыпетливания из длинной 3’-нетранслируемой области. Такая замкнутая петлеваяструктура, как считается, пообствует трансляции, эффективно рекрутируя ирециклизуя терминирующую рибосому к следующему раунду инициации трансляции(см. Hoshino et al., 2012).Ассоциация eRF3 и Pab1 позволяет отличать истинный стоп-кодон отпреждевременного.
У дрожжей, как и у большинства эукариот, неэффективнаятерминация трансляции на преждевременном стоп-кодоне активирует NMD-путьдеградации РНК (см. раздел 1.1.2.4). Однако недавно были обнаружены организмы, укоторых все 3 стоп-кодона могут являться кодирующими (Heaphy et al., 2016; Swart etal., 2016; Záhonová et al., 2016).
Выяснилось, что у таких организмов близостьстоп-кодона к polyA прямо влияет на эффективность его распознавания в качестветерминирующего, а потому. авторы полагают, что взаимодействие PABP c eRF3может служить необходимым сигналом для декодирования стоп-кодона не в качествепреждевременного, а потому значащего, а как терминирующего (Swart et al., 2016).191.1.1.4. Транскрипционная регуляция экспрессии генов, кодирующихфакторы терминации трансляции1.1.1.5. Белки, взаимодействующие с факторами терминации трансляцииМутации в дрожжевых генах SUP35 и SUP45, помимо омнипотентнойнонсенс-супрессии, характеризуются наличием многочисленных плейотропныхэффектов, что говорит о наличии функций кодируемых ими белков, не связанных стерминацией трансляции. К этим плейотропным эффектам относятся: летальностьпри повышенной и пониженной температуре, полная или частичная неспособность кдыханию,чувствительностьаминогликозиднымкантибиотикамповышенномуосмотическомупаромомицину,неомицинудавлению,идр.к(см.Inge-Vechtomov et al., 2003).
Кроме того, инактивация SUP35 и SUP45 можетприводить к остановке клеточного цикла на стадии G1 (Kikuchi et al., 1988).Результаты множества исследований позволяют предположить роль Sup35 иSup45 в организации цитоскелета. Так, снижение уровня экспрессии генов SUP35 иSUP45, или их частичная инактивация приводит к появлению чувствительности кбеномилу (агент, деполимеризующий микротрубочки) и нарушению расхожденияхромосом в митозе (Tikhomirova & Inge-Vechtomov, 1996; Borchsenius et al., 2000), ксерьезным изменениям в структуре актинового цитоскелета и веретена деления и,как следствие, к нарушениям кариокинеза, не связанных с нонсенс-супрессией,возникающей на фоне нехватки факторов терминации (Valouev et al., 2002). Есть идругие данные и о связи факторов терминации с актиновым цитоскелетом: показано,что Sup35 взаимодействует с ассоциированными со сборкой микрофиламентовбелками Sla1, Sla2, End3, Arp2 и Arp3 (Baileul et al., 1999; Ganusova et al., 2006;Bagriantsev et al., 2008).
В свою очередь, eRF1 взаимодействует с легкой цепьюмиозина – белком Mlc1. У мутантов sup45 наблюдается перераспределение белкаMlc1, в результате чего снижается количество данного белка в формирующейся20почкеинарушаетсяцитокенез.Такимобразом,eRF1можетприниматьнепосредственное участие в процессе почкования у S. cerevisiae, влияя на цитокинез(Valouev et al., 2004). Наконец, несколько мутаций act1 в гене, кодирующем актин,приводят к нонсенс-супрессии (Kandl et al., 2002), и хотя механизм проявления этихмутацийнеизвестен,неисключено,чтоонсвязансовзаимодействиемактин-ассоциированных комплексов с факторами терминации трансляции.1.1.2.
Факторы, влияющие на нонсенс-супрессиюКак известно, все матричные процессы в клетке происходят с высокойточностью, однако в ходе эволюции был отобран оптимальный уровень ошибок, илинеоднозначности, который имеет адаптивное значение для организма. В случаетрансляции принцип поливариантности матричных процессов может проявляться вразличных способах считывания кодонов мРНК, а также в изменении рамкисчитывания (см. Инге-Вечтомов, 2015).Возможность ошибочного считывания стоп-кодонов как значащих послужилаосновой для создания удобной и эффективной модели для изучения точноститрансляции.
В этой модели оценивается эффективность нонсенс-супрессии, т.е.супрессии мутаций, обусловленных появлением преждевременного нонсенс-кодона воткрытой рамке считывания, или нонсенс-супрессии.1.1.2.1. Супрессорные тРНКНонсенс-супрессия может быть обусловлена различными событиями, какмутационной, так и немутационной природы. Прежде всего, прочтение стоп-кодоноввызывают мутации, изменяющие последовательность антикодона в тРНК.
Такиенонсенс-супрессоры обычно доминантны и демонстрируют строгую кодоновуюспецифичность. У эукариот они подробно изучены у дрожжей S. сerevisiae, где онибыли идентифицированы в основном в генах, кодирующих тирозиновые, сериновыеи лейциновые тРНК (Murgola, 1985).21Но даже когда в клетках нет кодон-специфичных супрессоров, осмыслениестоп-кодонов может быть осуществлено и за счет естественных, латентныхсупрессорныхтРНК,антикодоныкоторыхмогутвзаимодействоватьсостоп-кодонами в нарушение канонических правил спаривания нуклеотидов (Beier &Grimm, 2001). Тот факт, что стоп-кодоны, хоть и с низкой эффективностью, но могутпрочитываться даже при отсутствии в штамме супрессорных мутаций, был впервыеобнаружен ещё в 60-е годы прошлого века (Rosen et al., 1969). Сверхэкспрессиянекоторых генов тРНК может значительно усиливать нонсенс-супрессию (Pure et al.,1985; Lin et al., 1986).
Именно существование естественных нонсенс-супрессорныхтРНК и обуславливает возможность прочитывания стоп-кодонов как значащих вовсех случаях, не связанных с мутационными изменениями в тРНК.Неправильное прочтение нонсенс-кодона в ходе сквозного прочитыванияможет быть опосредовано неправильной тРНК с одним (когда тРНК «почтиподходящая» (near-cognate)) или множеством (тРНК «неподходящая» (noncognate))нестандартных Уотсон-Криковских пар оснований в кодоне и антикодоне.
Механизм,который минимизирует включение неправильных аминоацил-тРНК в ходе элонгациитрансляции, имеет два компонента: выбор тРНК, находящейся в комплексе сфактором элонгации, и «кинетическая коррекция» после гидролиза ГТФ факторомэлонгации (Zaher & Green, 2009). Для конкретного кодона в А-сайте рибосомы,судьба приходящей аминоацил-ТРНК основана на степени соответствия оснований ина определении этого соответствия оснований окружающей рРНК (Keeling et al.,2014, Westhof et al., 2014).
«Подходящая» (cognate) тРНК способна индуцироватьгидролиз ГТФ, как и «почти подходящая» тРНК, хотя это привносит ошибкутрансляции. Однако «неподходящая» тРНК неспособна индуцировать гидролиз ГТФи, таким образом, не может быть «принята» А-сайтом (Westhof et al., 2014). Недавниекристаллические структуры рибосом позволили выявить, что А-сайт можетдопустить нестандартные Уотсон-Криковские пары оснований, и решающеезначение имеет форма пар оснований, а не количество или тип водородных связей,22которые они формируют (Westhof et al., 2014). Более того, было предположено, что«геометрическая мимикрия» нестандартных Уотсон-Криковских пар являетсямеханизмом, способствующим включению «почти подходящих тРНК (Westhof et al.,2014; Demeshkina et al., 2013).
В нескольких предыдущих исследованиях былипредприняты попытки идентифицировать аминокислоты, встраивающиеся при PTC(Pure et al., 1985; Beier & Grimm, 2001; Feng et al., 1990). В экспериментах in vitro слизатом ретикулоцитов кролика было идентифицировано встраивание триптофана,аргинина и цистеина в положении кодона UGA (Feng et al., 1990). Исследования,посвященные встраиванию аминокислот в положениях кодонов UAA и UAG ввирусных мРНК, обнаружили только присутствие глутамина (Feng et al., 1990;Yoshinaka et al., 1985).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
