Диссертация (1145681), страница 2
Текст из файла (страница 2)
При этом копирование информациитакже происходит в соответствии с матричным принципом: конформация одногобелка служит матрицей, определяющей конформацию другого. Важно, что такоеизменение конформации влияет на функциональность белков, а значит, можетприводить к появлению новых признаков без изменения генотипа, а передача белковс модифицированной структурой в дочерние клетки обеспечивает наследуемостьприобретенного фенотипа (Инге-Вечтомов, 2013). Белки, способные существовать в7нескольких конформациях, одна из которых способна передаваться в клеточныхпоколениях, называются прионы.
Изначально интерес к прионам был связан сизучением губчатых энцефалопатий млекопитающих. К ним относится губчатаяэнцефалопатия рогатого скота (коровье бешенство), скрэйпи овец и некоторыенейродегенеративные заболевания человека: куру, болезни Крейцфельда-Якоба,Герстмана-Штраусслера-Шейнкера и семейная фатальная бессонница. Открытиеприонных белков у дрожжей-сахаромицетов показало, что у низших эукариотсуществование прионов приводит к появлению цитоплазматически наследуемыхгенетических элементов (см. Wickner, 1996). К настоящему времени известно околодвенадцати прионов у Saccharomyces cerevisiae и Podospora anserina. Средиизвестных прионных белков низших эукариот многие в норме выполняют функции,связанные с регуляцией экспрессии генов: большинство из них являются факторамитранскрипции, а по крайней мере два известных приона дрожжей, [PSI+] и[NSI+]/[SWI+], влияют на синтез белка в клетке, в частности, на эффективностьтерминации трансляции (см.
Crow & Li, 2011). Дрожжи представляют собойодновременно простую и удобную систему, как для изучения механизма белковогосинтеза, так и для изучения свойств прионов. Данная работа посвящена поиску иизучению факторов, для которых ранее не было показано влияние на прионы и натерминацию трансляции, с помощью разработанной в нашей лабораториитест-системы синтетической летальности, которая позволяет уловить слабыеизменения в эффективности нонсенс-супрессии, обусловленные либо регуляциейработы факторов терминации трансляции, либо изменением свойств приона [PSI+].81. Терминация трансляции и прионы дрожжей (обзор литературы)Терминация трансляции – финальный этап матричного синтеза полипептидов.Во время предшествующего этапа (элонгации), аминоацил-тРНК последовательносвязываютсястриплетамивА-сайтерибосомы,послечегозасчётпептидил-трансферазной реакции растущая белковая цепь из Р-сайта переносится нааминоацил-тРНК в А-сайте.
Далее рибосома продвигается по цепи мРНК на одинтриплет и белковая цепь оказывается в Р-сайте, а А-сайт принимает следующуютРНК. Процесс повторяется до тех пор, пока в А-сайте не оказывается один из трёхстоп-кодонов: UAA, UAG и UGA; это событие является сигналом к началутерминациитрансляции.ВпроцессетерминациитрансляциикА-сайтуприсоединяется не аминоацил-тРНК, а белковые факторы, так как в норме в клеткеотсутствуют тРНК с антикодонами, полностью комплементарными стоп-кодонам.Пептидил-тРНК гидролизуется, благодаря чему высвобождается синтезированныйпептид, мРНК и факторы терминации покидают рибосому, которая должна пройтиэтап рециклизации, прежде чем сможет вновь катализировать белковый синтез (Рис.1;см.
Dever & Green, 2012). Процесс терминации обслуживается факторамитерминации трансляции (или Release Factors - RFs). Белки, относящиеся к факторамтерминации трансляции I класса, отвечают за распознавание стоп-кодонов,находящихся в А-сайте рибосомы. Они же осуществляют гидролиз пептидил-тРНК.Факторы терминации трансляции II класса стимулируют работу факторов I класса засчет своей ГТФазной активности.9Рисунок 1. Модель терминации трансляции и рециклизации рибосомы. По Dever & Green,2012.1.1. Факторы, влияющие на эффективность терминации трансляции уSaccharomyces cerevisiaeИзучение факторов, влияющих на терминацию трансляции у дрожжейначалось задолго до того, как был установлен молекулярный механизм этогопроцесса. Связано это с тем, что классический генетический подход работы сдрожжами включает анализ мутаций, приводивших к возникновению зависимостижизнеспособности клеток от присутствия в среде определённого вещества (какправило, аминокислоты или азотистого основания), т.е.
к ауксотрофности по этомувеществу. В 60-е годы XX века активно изучалось явление супрессии, при которомпроявление мутаций в одних генах подавлялось другими генами. Супрессоры,которыеаллель-специфичносупер-супрессорамиподавляли(Hawthorne&различныеMortimer,нонсенс-мутации1963),аназваливпоследствии,нонсенс-супрессорами, и по большей части они наследовались доминантно(Hawthorne & Mortimer, 1968). Уже тогда возникло предположение, что супрессиянонсенс-мутаций может быть связана с изменениями в тРНК, приводящими кпрочтитыванию стоп-кодонов (Gilmore & Mortimer, 1966; Magni et al., 1966), и былиполучены экспериментальные подтверждения этой гипотезы (Inge-Vechtomov et al.,1966;Manney,1968;Shermanetal.,101968).Открытиерецессивныхнонсенс-супрессоров,которыевотличиеотмутантныхтРНКоказалисьомнипотентными, т.е. способными супрессировать нонсенс-мутации, вызванныеразными типами стоп-кодонов, означало, что у дрожжей должны существовать ибелковые факторы, отвечающие за распознавание стоп-кодонов (Инге-Вечтомов иСимаров, 1967).
C помощью теста на аллелизм было показано, что генов,кодирующих эти факторы два: s1 и s2 (Инге-Вечтомов и Андрианова, 1970), они жеSUP45 и SUP35, соответственно.С тех пор скрининги, направленные на поиск супрессоров, антисупрессоров иаллосупрессоров у дрожжей проводились неоднократно, что позволило установитьмножество механизмов, приводящих к нонсенс-супрессии, однако, значительная ихчасть связана с изменениями в работе факторов терминации трансляции eRF1 (Sup45)и eRF3 (Sup35).1.1.1.
Факторы терминации трансляции у дрожжейВ терминации трансляции у эукариот принимают участие два белковыхфактора eRF1 и eRF3, которые у дрожжей S. cerevisiae кодируются генами SUP45 иSUP35, соответственно. В отличие от бактериальных клеток, у которых несколькофакторов в разной степени способны распознавать различные стоп-кодоны (Scolnicket al., 1968; Ito et al., 2000), у дрожжей, как и у других эукариот, единственныйфактор терминации I класса eRF1 отвечает за распознавание всех трёх стоп кодонов(Frolova et al., 1994).
eRF3 является ГТФазой и способствует работе eRF1(Zhouravleva et al., 1995; Frolova et al., 1996). Эукариотические факторы терминациивзаимодействуют друг с другом физически и для выполнения своей функции in vivoдолжны формировать комплекс друг с другом (Stansfield et al., 1995; Zhouravleva et al.,1995). Распознавание стоп кодонов у эукариот происходит в соответствии с модельюмолекулярной мимикрии, согласно которой комплекс факторов терминацииимитирует структуру комплекса аминоацил-тРНК и фактора элонгации eEF1A (Songet al., 2000).111.1.1.1. Фактор eRF1 (Sup45)Фактор eRF1 кодируется геном SUP45 у S.
cerevisiae. Последовательностьэтого гена содержит 1311 пар оснований; кодируемый белок состоит из 437аминокислотных остатков, и имеет молекулярную массу 49 кДа (Breining andPiepersberg 1986). В структуре eRF1 выделяют три домена, обозначаемых как N, M иC (Frolova et al., 2000; Song et al., 2000). В соответствии с моделью молекулярноймимикрии, их положение в пространстве соответствует антикодоновой петле,акцепторному стеблю и Т-петле тРНК, соответственно (Song et al., 2000).Основная функция N-концевого домена состоит в узнавании стоп-кодона.Предположение о роли N-домена eRF1 в распознавании стоп-кодонов было впервыесделано на основании данных рентгено-структурного анализа eRF1 человека (Song etal., 2000), и почти сразу получило подтверждение благодаря мутационному анализуSUP45 в S. cerevisiae.
С помощью различных, как биохимических, так и генетическихподходов было установлено, что наиболее важную роль в распознаваниистоп-кодонов играют консервативные мотивы NIKS, YxCxxxF и GTS-петля. Поструктуре, мотив NIKS представляет собой петлю между двумя α-спиралями, котораяпространственно расположена вблизи района YxCxxxF (Song et al., 2000). Методомперекрёстных сшивок и с помощью анализа терминационного комплекса in vitroбыло показано, что лизин из мотива NIKS непосредственно участвует враспознавании U в 1-м положении стоп-кодона (Frolova et al., 2002; Chavatte et al.,2002; Bulygin et al., 2010), а мотив YxCxxxF отвечает за распознавание аденозинов игуанозинов 2-м и 3-м положениях (Kolosov et al., 2005; Cheng et al., 2009; Conard etal., 2012). Кроме того, сравнительный анализ вариантов YxCxxxF из различныхорганизмов с неканоническими генетическими позволил установить, что этот мотивтакжеотвечаетзаомнипотентнуюспецифичностьeRF1дрожжейилимлекопитающих, т.е.
за способность распознавать все 3 канонических стоп-кодона(Seit-Nebi et al., 2002; Wong et al., 2012). Также было показано, что остаток треонинаиз мотива GTS либо непосредственно связывается со стоп-кодоном, либо участвует в12его декодировании, причём, как замены в мотиве YxCxxxF, так и присутствиеразличных стоп-кодонов может приводить к изменению конформации N-домена, и,как следствие, изменению положения GTS относительно стоп-кодона (Cheng et al.,2009; Bulygin et al., 2010, 2011; Wong et al., 2012).Основные выводы приведённых выше исследований были сделаны на основерасшифровки кристалличестких структур eRF1 или комплекса eRF1 с eRF3 (Song etal., 2000; Cheng et al., 2009), которые, однако, не могли учитывать возможныеконформационные изменения eRF1 в составе терминационного комплекса срибосомой. Хотя предпринимались попытки реконструировать структуру комплексафакторов терминации, рибосомы и мРНК, полученные модели обладали низкимразрешением (Taylor et al., 2012; des Georges et al., 2014), и почти не привносилиновых данных к известным кристаллическим структурам eRF1 и eRF3, не связанныхс рибосомой.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
