Диссертация (1145681), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Б. Викнер представил экспериментальные подтверждениясуществования прионов у дрожжей S. cerevisiae и предположил, как прионнаяприрода объясняет свойства двух известных на тот момент нехромосомныхнаследственных факторов дрожжей (Wickner, 1994). Позже он сформулировалгенетические критерии, отличающие прионы от всех прочих наследственныхдетерминант клетки (Wickner, 1996):1. Обратимое излечивание или изгнание. Прионные фенотипы [PSI+] и [URE3]можно элиминировать путём выращивания на среде, содержащей гидрохлоридгуанидина (ГГХ). Такое излечивание обратимо и связано с тем, что при росте насреде с GuHCl обратимо ингибируется шаперон Hsp104 (Ferreira et al., 2001; Jung etal., 2000), который необходим для поддержания почти всех прионов.
Важно, что этоизлечивание обратимое, т.к. прионы способны вновь спонтанно возникать в клеткахпосле их изнания. Элиминация прионов может быть вызвана ингибированием нетолько Hsp104, но и других шаперонов семейств Hsp40, Hsp70 и Hsp90 (Higurashi etal., 2008; Chakrabortee et al., 2016).2. Сверхпродукция прионного белка повышает частоту возникновения прионаde novo. Например, амплификация гена SUP35 в клетках ведет к возникновениюфенотипа [PSI+] (Chernoff et al., 1993), а частота появления [URE3] возрастает привведении дополнительных копий гена URE2 (Wickner, 1994). Впоследствиивыяснилось, что подобный эффект связан с тем, что многие прионы дрожжей, в томчисле и [PSI+] и [URE3], представляют собой наследуемые амилоидные агрегаты37соответствующих белков (Glover et al., 1997; King et al., 1997), а повышениеконцентрации молекул белка в клетке повышает вероятность их коагрегации.3.
Экспрессия гена, кодирующего прионный белок в клетке, необходима дляподдержания прионного фенотипа, а клетки, несущие прионный детерминант,обладают фенотипом, схожим с таковым у мутантов по данному гену. То есть,инактивация белка, происходящая как из-за его прионизации, так и в следствиемутации в соответствующем гене, как правило, приводит к схожим фенотипическимпроявлениям.
С точки зрения функциональности прионных белков, их переход вприонную форму часто (но не всегда) сопровождается утратой функций, так как вклетке резко снижается концентрация свободного, функционального белка.Кроме описанных генетических критериев, впоследствии были обнаружены идругие характеристики, общие для разных прионов, прежде всего амилоидных.Прионным агрегатам свойственны те же биохимические характеристики, что ипрочим амилоидам: они состоят из фибрилл или филаментов, устойчивы к протеазам,обогащены β-слоями и окрашиваются Конго Красным и Тиофлавином Т (Kirschner etal.
2000; Kimura et al. 2003). Для большинства известных прионов дрожжей показанаспособность их структурных белков к формированию амилоидов как in vivo, так и invitro (King & Diaz-Avalos, 2004; Patel & Liebman, 2007; Tanaka et al., 2004). Хотя естьразличия в структуре агрегатов различных белков, лежащие в их основе амилоидныефиламенты, устроены по единому принципу (Chien et al., 2004; Dobson, 2004). Наданный момент считается, что амилоиды [URE3+], [PSI+] и [PIN+] состоят из β-слоёв,параллельных друг другу и перпендикулярных оси фибриллы, не сдвинутых друготносительно друга по регистру (parallel in-register β-sheet structures) (Рис.
3). Этоозначает, что, например, аминокислотный остаток №35 одной молекулы находится наодной линии с аминокислотными остатками №35 всех последующих молекул, тоесть, в одном регистре (Shewmaker et al. 2006; Baxa et al. 2007; Wickner et al. 2008).Поддержание β-структур в регистре обеспечивается тремя механизмами:1.
формированием так называемой структуры «β-молнии», образуемой38трактами N и Q за счет водородных связей;2. путем образования водородных связей между остатками S и T;3. гидрофобными взаимодействиями между идентичными аминокислотнымиостатками. На данный момент можно считать доказанным, что амилоиды Sup35,Ure2 и Rnq1 обладают архитектурой параллельных β-слоёв «в регистре» (по Wickneret al., 2010).Рисунок 3. Структура амилоидной фибрилы Sup35NM. По Wickner et al., 2007.Крупные прионные агрегаты, выявляемые градиентным центрифугированиемили даже видимые на светооптическом уровне, состоят из более мелких гранул,устойчивых к протеазам и детергентам (SDS). Считалось, что эти гранулы являютсянаследуемымиинфекционнымиединицамиприонов,называемымитакжеприонными «зёрнами» или пропагонами (Derkatch and Liebman 2007), однако впоследние годы появляются данные, указывающие на то, что в роли пропагоновмогут выступать неагрегированные в гранулы прионные фибриллы (Kawai-Noma etal.
2010) и, возможно, существует система направленного транспорта пропагонов вклетке (Liu et al. 2010; Tyedmers et al. 2010).Повышенное содержание остатков N и Q является общей особенностью почти39всех выявленных амилоидных дрожжевых прионов (кроме [MOD+]), так как именноэти аминокислоты стабилизируют характерную для большинства прионныхамилоидов структуру фибриллы. При этом важно именно высокое содержание этихостатков, а конкретные последовательности, которые формируют аминокислоты,существенной роли не играет (Ross et al. 2005). Это позволило использоватьповышенное содержание этих аминокислот в белке в качестве критерия для поискапотенциально прионогенных белков. Впервые такая работа была сделана в 2000 годув лаборатории Вейссмана.
В результате был составлен так называемый «списокВейсмана», включающий в себя 107 белков, которые могут быть прионами(Michelitsch and Weissman 2000). Впоследствии было проведено ещё несколько работс использованием более сложных алгоритмов поиска (Alberti et al.
2009; Harrison andGerstein 2003; Ross & Toombs 2010). На их основе была создана база данных прионови потенциально прионогенных белков (Harbi et al. 2012).На сегодняшний день у S. cerevisiae и P. anserina известно около десятиприоноподобных детерминантов, в той или иной мере отвечающих всем этимхарактеристикам. Они представлены в Таблице 1. Детерминанты [β], [C] и [GAR+]тоже удовлетворяют всем критериям, однако от остальных прионов их отличаетотсутствие амилоидных структур. Их, тем не менее, можно считать неамилоиднымиприонами.
Недавнее исследование, проведённое в лабораториях C. Линдквист и Д.Ф.Джэроса показало, что могут существовать ещё около 50 подобных факторов,которые возникают в ответ на временную сверхпродукцию белков дрожжей,стабильно поддерживаются в клеточных поколениях, но не связаны с образованиемамилоидных агрегатов (Chakrabortee et al., 2016). Таким образом, список известныхприонов можно было бы сильно расширить, однако, в Таблице 1 мы приводим лишьхорошо изученные, «канонические» прионы.
Прионный статус детерминанта [ISP+],согласно последним данным, является весьма сомнительным (Drozdova et al., 2016;Дроздова, 2016). Статус фактора [MCA+] на данный момент также не до конца ясен(см. Drozdova & Matveenko, 2015).40Таблица 1. Известные прионы и прионоподобные факторы у грибов (по Drozdova & Matveenko,2015, с дополнениями).ПрионБелокФункция белкаОбогащё Формированиенностьамилоидов/Q/Nзависимость отHsp104[β]Prb1вакуолярная протеаза Bнетнет/нет[C]*PaASK1 MAPKKKда**нет/?+[GAR ]?нет/нет[Het-s]*Het-sвегетативнаянетда/да***несовместимость[ISP+]†Sfp1регуляция транскрипциида?/нет(биогенез рибосом)[MCA+]††Mca1метакаспазадада#/?[MOD+]Mod5модификация тРНК (тРНК нетда/даизопентинилтрансфераза)[MOT3+]Mot3регуляция транскрипциидада/да+[NSI ]?-/да[NUP100+]Nup100 формирование ядернойдада/дапоры[OCT+]Cyc8регуляция транскрипциидада#/да[PIN+]/[RNQ1+] Rnq1неизвестнадада/да[PSI+]Sup35терминация трансляциидада/да(фактор eRF3)[SWI+]/[NSI+]Swi1ремоделированиедада/дахроматина[URE3]Ure2регуляция транскрипциидада/да(метаболизм азота)*, детерминант обнаружен у Podospora anserina;**, Q-богатая последовательность PaASK1 не влияет на [C];***, инактивация PaHsp104 не приводит к потере [Het-s] из-за синцитиальной структуры организма,но привоит к невозможности передачи приона при мейозе;†, новые данные о природе фактора ISP+ не согласуются с опубликованными данными о егоприонных свойствах;††, исходная статья отозвана;#, показано только связывание агрегатов с тиофлавином Т и их устойчивость к обработкедетергентами;?, не определено;-, невозможно установить.411.2.1.2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
