Диссертация (1145681), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Таким образом, в активацию NMD у дрожжей можетбыть вовлечено что-то более сложное, чем соревнование между этими факторами(Kervestin et al., 2012).Мутантные аллели NAM7 (UPF1), NMD2 (UPF2) и UPF3, кодирующихкомпоненты NMD в дрожжах, изначально были выделены как слабые рецессивныеомнипотентные нонсенс-супрессоры sup113, sup111 и sup112, соответственно (Ono etal., 1982; Ono et al., 2005).
Но в то же время несколько исследований направленнотестировали эффекты известных компонентов NMD на точность терминациитрансляции, и нонсенс-супрессия была детектирована у штаммов upf1Δ, upf2Δ иupf3Δ (Leeds et al., 1992; Cui et al., 1995; Weng et al., 1996; Weng et al., 1996b, см. Wanget al., 2001). Хотя наиболее простым объяснением этих фенотипов могла бы бытьстабилизация нонсенс-содержащих транскриптах в штаммах, дефицитных по NMD,экспериментыговорятобвзаимодействиекомпонентовальтернативныхNMDсобъяснениях,факторамитерминациивовлекающихтрансляции.Действительно, нонсенс-супрессия в присутствии нарушений или мутаций в UPF независела от их эффектов на оборот мРНК (Weng et al., 1996; Weng et al., 1996b, см.Wang et al., 2001).
Также, существуют доказательства того, что Upf1 влияет на способтрансляции стоп-кодонов: декодирование преждевременных стоп-кодоном факторомтерминации нарушено, но только в присутствии Upf1 (Amrani et al., 2004).В отличие от дрожжей, подавление активности человеческого UPF1 спомощьюРНК-интерференции, как было показано, уменьшает нонсенс-супрессию,что неожиданно, если учитывать консервативность аппаратов терминации и NMD(Ivanov et al., 2008).32Эти несоответствия были разрешены недавно при идентификации мутаций,которые обращают фенотип сквозного прочитывания у дрожжевых делеционныхмутантов upf1 (upf1Δ)107.
Это исследование показало, что мРНК, кодирующаяглавный дрожжевой транспортер ионов магния, Alr1, содержит uORFs и являетсяэндогенным субстратом NMD. Когда NMD инактивирован, мРНКALR1стабилизируется, что в свою очередь приводит к увеличению клеточных уровнейAlr1. Как следствие, внутриклеточные уровни ионов магния также возрастают, такимобразом уменьшая точность терминации трансляции (Johansson & Jacobson, 2010).Таким образом, хотя Upf1 взаимодействует с факторами терминации, эти результатыповоляют предположить, что, по меньшей мере у дрожжей, его влияние натерминацию трансляции является в большой степени непрямым.NGD находит и деградирует мРНК, которые застревают на этапе элонгациитрансляции (Doma and Parker, 2006). Распад мРНК, являющейся субстратом NGD,инициируется эндонуклеолитическим разрезанием вблизи от сайта застревания.5’-фрагмент мРНК затем деградирует в цитоплазматической экосоме, а 3’-фрагментдеградируется за счёт 5’-3’-эндонуклеазы, Xrn1.
Мишенями NGD являются мРНК состановками трансляции, вызванными определенными структурами РНК, а такжередкими кодонами и преждевременными стоп-кодонами в некоторых условиях. Болеетого, было показано, что в клетках дрожжей NGD деградирует депуринизированныемРНК (Gandhi et al., 2008), позволяя предположить NGD также работает наповрежденных мРНК, имеющих дефекты в элонгации трансляции. В соответствии спредположением, что NGD распознает застрявшие рибосомы, белки Hbs1 и Dom34,которые связаны с факторами терминации трансляции (Inagaki & Ford Doolittle, 2000),стимулируют эндонуклеолиическое разрезание в ходе NGD у дрожжей (Doma &Parker, 2006). Hbs1p является членом семейства ГТФаз, включающего в себя такжеeEF1, который доставляет тРНК к А-сайту рибосомы (Inge-Vechtomov et al., 2003);eRF3, который работает в терминации трансляции (Jackson, 2007) и Ski7p, который,как было предположено, взаимодействует с пустым А-сайтом, когда рибосома33достигает 3’-конца мРНК в ходе NSD (van Hoof et al., 2002).
Dom34p связывается сHbs1p (Carr-Schmid et al., 2002; Lee et al., 2007; Graille et al.,2008) и связан с eRF1,который имеет трехмерную структуру, сходную с тРНК (Kong et al., 2004).Структурный анализ Dom34 и сходного белка у архей показывает, что его два доменапохожи на eRF1, но N-терминальный домен сильно отличается от такового у eRF1(Lee et al., 2007; Graille et al., 2008). Сходство Dom34 с eRF1 позволяет предположить,что он работает аналогично eRF1, но при этом N-терминальный домен Dom34выполняет другую роль.Недавно были определены структуры частей комплексов eRF1:eRF3 и ихгомологов Dom34:Hbs1 (Cheng et al. 2009; Chen et al.
2010). Структура eRF1:eRF3включает в себя полноразмерный eRF1, но у eRF3 отсутствует несущественныйаминотерминальный домен, а также ГТФазный домен. Структура Dom34:Hbs1включает в себя все домены каждого из белков. Судя по этим структурам, факторысвязаны друг с другом через их карбокситерминальные домены. Более того, в обоихслучаях связывание ГТФазных факторов (eRF3/Hbs1) приводит к существеннымконформационным изменениям в eRF1/Dom34, приводя к тому, что формапоследнего становится более похожей на форму молекулы тРНК.
Соответственно,реконструирование с помощью криоэлектронной микроскопии показало, чтоeRF1:eRF3 и Dom34:Hbs1 связываются с эукариотическими рибосомами подобнотому, как тРНК связывается с eEF1A (Becker et al. 2011).Третьим механизмом контроля качества мРНК является система NSD, котораяизначальна была описана у дрожжей (Frischmeyer et al., 2002, van Hoof et al.,2002).NSD - это механизм, который удаляет транскрипты, не содержащиестоп-кодоны (см. Vasudevan et al., 2002; Klauer & van Hoof, 2012). мРНК безстоп-кодона может образоваться за счет преждевременного полиаденилирования вядре или случайного разрезания внутри открытой рамки считывания РНК. В этойсистеме, член семейства eRF3, Ski7, играет центральную роль в инициации распадамРНК.Ski7связываетсясцитоплазматической34формойэкзосомыисвспомогательными белками (Ski2, Ski3 и Ski8) N-терминальный домен (Araki et al.,2001).
Когда мРНк без стоп-кодона транслируется рибосомой, рибосома застреваетна 3’-конце мРНК. В этой ситуации застрявшая рибосома частично или полностьюсвободноа от кодонов в А-сайте А..Ski7, как считается, распознает пустой А-сайтсвоим C-терминальным доменом. Предполагается, что Ski7 распознает 3’-конецмРНК без стоп-кодона за счет связывания с рибосомой и инициирует деградациютранскрипта, при этом высвобождая застрявшую рибосому и рекрутируя экзосому ктранскрипту (van Hoof et al., 2002). Таким образом, мРНК без стоп-кодонадеградирует от 3’- к 5’- концу с помощью экзосомы.
Однако, Ski7 обнаружен толькоу семейства сахаромицетов, и очевидных его ортологов у высших эукариот необаружено (Atkinson et al., 2008). Из членов семейства eRF3, наиболее близким кSki7 является Hbs1, который считается регулятором NGD. Однако было обнаружено,что Hbs1 вовлечен в NSD в клетках млекопитающих и в дрожжах (Hoshino et al., 2012,Tsuboi et al., 2012). Таким образом, считается, что Hbs1 является регулятором NSD увысших эукариот, а сахаромицеты развили специализированный механизм NSD, вкоторый вовлечены два члена семейства NSD.351.2. Связь прионов с терминацией трансляции у дрожжей1.2.1. Прионы дрожжейПрионы – белки, способные существовать в нескольких конформациях, одна изкоторых способна передаваться другим молекулам этого или близкого по структуребелка и передаваться к другим организмам либо в ряду клеточных поколений засчётделений клеткок, либо благодаря инфекционным свойствам (см.
Prusiner, 1996;Wickner et al., 2007).Возникновение и накопление прионной формы некоторых белков являетсяпричинойнесколькихмлекопитающих.Кнеизлечимыхтакимболезнямнейродегенеративныхотносятся,взаболеванийчастности,болезниКрейцфельдта-Якоба и куру у человека, скрейпи у овец, а также губчатыеэнцефалопатии крупного рогатого скота. При этих заболеваниях накопление в тканяхцентральнойнервнойсистемыособыхамилоидныхбляшек(отложенийагрегированной и устойчивой к действию протеаз прионной формы белка PrPSC)приводит к летальному исходу.В то время как у млекопитающих прионы вызывают развитие инфекционныхнейродегенеративныхзаболеваний,способностьнекоторыхбелковдрожжейSaccharomyces cerevisiae и плесневого гриба Podospora anserina переходить вприонноесостояние,поддерживаемоеавтокаталитически,обуславливаетвозникновение нехромосомно наследуемых признаков, причём эти признаки могутиметь адаптивное значение.
Прионы низших эукариот, таким образом, являются«генами, состоящими из белков вместо нуклеиновых кислот» (Wickner et al., 1999).Существованиеприоновподтверждаетвозможностьпередачиконформационной наследственной информации, без непосредственного участия ДНКи РНК, засчёт т.н. матричных процессов II рода (см. Инге-Вечтомов, и др., 2004). Впоследние годы появилась концепция, рассматривающая прионы у грибов в качествебимодулярныхнаследственныхэлементов,включающиххромосомнуюсоставляющую (ген, кодирующий прионный белок) и эпигенетическую (в случае36прионов - это конформационная информация, закодированная в структуреконкретной прионной формы белка) (Tikhodeyev et al., 2017). Таким образомизучение прионов не только вносит вклад в понимание процессов нейродегенерации,организации белковых комплексов, их наследования и инфекционности, но ирасширяет понимание глобальных биологических процессов.1.2.1.1. Основные свойства прионов дрожжейВ 1994 году Р.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
