Диссертация (1145681), страница 10
Текст из файла (страница 10)
6,этап 3А) и связывается с Hsp70 (Ssa), активируя его. После присоединения Hsp7048(Рис. 6, этап 3Б) становится возможным узнавание этого комплекса Hsp104, которыйсвязывается и разрезает фибриллу, путём выщепления из неё мономера итранслокации его через центральную пору гексамера Hsp104 (Рис. 6, этап 3В).Поддержание подобной активности позволяет амилоидным фибриллам динамичноувеличивать количество свбодных концов фибрилл, позволяя присоединять новыемономеры (Рис. 6, этап 2) и обеспечивая клетку достаточным количествомпропагонов для стабильного наследования приона (Рис. 6, этап 5) (см. Drozdova &Matveenko, 2015). После этого, аналогичные процессы фрагментации протекают вдочерней клетке (Рис.
6, этап 6) и далее в ряду клеточных поколений. Все этипроцессы описывают жизненный цикл амилоидных прионов (Inoue, 2009).Рисунок 6. Жизненный цикл амилоидных прионов и его регуляциясистемой шаперонов. По Drozdova & Matveenko, 2015.Для поддержания всех известных дрожжевых амилоидных прионов необходимбелок Hsp104 – шаперон из семейства Hsp100/ClpB. Hsp104 – АТФаза класса AAA+(ATPase associated with diverse cellular activities), он функционирует в виде49кольцевогогомогексамера,причёмкаждыйизпротомеровсодержит2нуклеотид-связывающих домена и может функционировать как АТФаза (Lee et al.,2010).
Hsp104 неспецифически взаимодействует с прионными агрегатами как in vitro,так и in vivo, и именно он осуществляет необходимую для поддержания прионовфрагментацию амилоидных фибрил (Romanova & Chernoff 2009). Обратимоеизлечивание прионов на среде с ГГХ обусловлено обратимой инактивацией Hsp104(Jung & Masison 2001; Jung et al., 2002). Единственный прион, которыйэлиминируется не только в отсутствие Hsp104, но и при его сверхпродукции – это[PSI+] (Chernoff et al., 1995). Вероятно, это связано с наличием специального сайтасвязывания с Hsp104 в М-домене Sup35 (129-148 а-к.) (Helsen & Glover 2012). Приэтом, для такого способа изгнания [PSI+] необходима интактная N-концеваяпоследовательность Hsp104, которая не требуется для поддержания [PSI+] и другихприонов (Hung & Masison, 2006; Winkler et al., 2012).
Возникло предоложение, чтосвязываниеN-концаHsp104напрямуюсагрегатами[PSI+]приводиткневозможности связывания Hsp104 через комплекс Hsp70/Hsp40, и таким образом,препятствует фрагментации фибрил и передаче их в дочерние клетки (Helsen &Glover 2012; Winkler et al., 2012). Недавние исследования показали, что связываниеN-конца Hsp104 с агрегатами [PSI+] приводит к нарушению сегрегации пропагоновот материнских клеток к дочерним, что и приводит к потере приона (Ness et al.,2017).Важную роль в регуляции прионов играют также шапероны семейств Hsp70 иHsp40.
Они, в отличие от Hsp104, взаимодействуют избирательно с различнымиприонами, и могут быть антагонистами. Так сверхпродукция Ssa1 (белка семействаHsp70) изгоняет [URE3], но не влияет на [PSI+] (Schwimmer & Masison 2002), аотсутствие этого белка ослабляет [PSI+], но не[URE3]. При этом мутация илиделеция в гене SSA2, кодирующем гомолог Ssa1, наоборот, приводит к потере [URE3],не ослабляя[PSI+] (Roberts et al., 2004; Hung & Masison 2006). Другойпредставитель семейства HSP70, шаперон Ssb1 также влияет на проявление прионов.50Было показано, что делеция SSB1 уменьшает эффективность элиминации [PSI+]шапероном Hsp104 (Chernoff et al., 1999), а сверпродукция Ssb1 приводит кэлиминации [PSI+] (Chacinska et al., 2001).Также было обнаружено, что на проявление дрожжевых прионов оказываютвлияниешаперонысемействаHsp40.Например,сверхпродукцияYdj1,принадлежащего этому семейству, приводит к постепенной элиминации [URE3](Moriyama et al., 2000).
Кроме того, повышение уровня экспрессии Ydj1, илигомологичного ему Apj1, ослабляет некоторые штаммы [PSI+] (Kryndushkin et al.,2002) и приводит к потере некоторых вариантов [PIN+] (Bradley et al., 2002). Другойбелок того же семейства Sis1 является необходимым для поддержания прионногостатуса как [PIN+] (Sondheimer et al., 2001), так и [PSI+], и [URE3] (Higurashi et al.,2008). Влияние основных групп шаперонов на поддержание [PSI+] и других прионовсуммировано в таблице 2.Таблица 2. Влияние шаперонов и кошаперонов на поддержание прионов (по Liebman &Chernoff, 2012).ШаперонСемействоБелокHsp100Hsp70Hsp104Ssa1-4Влияние на [PSI+]Влияние на другие прионыИзбытокИзбытокYdj1Недостаток илиотсутствиеИзлечиваетИзлечиваетДестабилизирует Дестабилизирует, препятствует↑Hsp104Дестабилизирует Защищает от, способствует↑Hsp104↑Hsp104СпособствуетПрепятствует↑Hsp104поддержанию?Не излечиваетApj1??Hsp90Hsp82Не влияетNEF (70)*Sse1?Защищает от↑Hsp104ИзлечиваетSsb1,2Hsp40Sis151Не влияетИзлечивает[URE3] (Ssa1,но не Ssa2)??Излечивает[URE3]Компенсируетydj1Δ?Излечивает[URE3]Недостаток илиотсутствиеИзлечиваетИзлечивает [URE3](Ssa2)?Излечивает [PIN+],[SWI+], [URE3]Излечивает [SWI+]??Излечивает [SWI+],[URE3]Fes1?Co-70/90** Sti1?ИзлечиваетИзлечивает[URE3]?Защищает от↑Hsp104Cpr1?Защищает от?↑Hsp104↑Hsp104 обозначает изгнание [PSI+] при сверхэкспрессии HSP104;*, факторы обмена нуклеотидов (NEF) для Hsp70;**, кошапероны, кофакторы для Hsp70 и Hsp90;?, не тестировалось;???Недавно было обнаружено влияние факторов сортинга шаперонов Сur1 и Btn2 на свойстваприонов [URE3] и [NRP1-C].
Предполагается, что эти факторы участвуют в сортинге шапероновмежду компартментами PQC (Рис. 7).Рисунок 7. Схема сортинга Sis1, опосредованного Cur1 и Btn2. По Malinovska et al., 2012.1.2.3. Модельные системы для поиска и изучения факторов, влияющих наприоны1.2.3.1. Токсичность прионов [PSI+] и [PIN+]Прионной токсичностью традиционно называется..Само присутствие приона [PSI+] может быть токсичным.
Описаны варианты[PSI+],приводящиекгибеликлетки52илизначительномуснижениюеежизнеспособности, что можно компенсировать добавлением С-домена Sup35(McGlinchey et al., 2011). Сверхпродукция полноразмерного белка Sup35 (или толькоегоPrD)токсичнадляштаммов[PSI+],нонеоказываетвлияниянажизнеспособность штаммов [psi-] (Derkatch et al., 1996). Эту токсичность nтакжеможно компенсировать сверхпродукцией С-домена Sup35, либо увеличениемсодержания белка Sup45 (Derkatch et al., 1998).Существует две точки зрения на причины возникновения токсичности [PSI+].Согласно первой, при сверхпродукции Sup35 или его PrD в клетке значительносокращается количество молекул белка Sup35 в мономерном состоянии, бóльшаячасть которого переходит в агрегаты.
Согласно второй, прионные агрегатызахватывают другие важные для жизнедеятельности белки (см. Liebman & Chernoff,2012), однако точные причины гибели клеток остаются неизвестны. В пользу первойгипотезы свидетельствует уменьшение количества растворимого белка Sup35 за счетего агрегации в штаммах [PSI+] (Patino et al., 1996; Paushkin et al., 1996). С этимхорошо согласуется ослабление жизнеспособности клеток, у которых сниженоколичество Sup35C (Valouev et al., 2002), при этом остаётся неясным, какое именноколичество белка Sup35 является минимально необходимым для поддержанияжизнеспособности. В пользу второй точки зрения говорят недавние исследования,показывающие, что агрегированный Sup35 сохраняет свои функции факторатерминации трансляции, а токсичность [PSI+] не коррелирует с уменьшениемколичества растворимого Sup35 и зависит от состава и размеров агрегатов Sup35(Pezza et al., 2014).Существуют свидетельства того, что токсичность [PSI+] связана с тем, что вагрегаты Sup35 входят другие жизненно важные белки.
Первым кандидатом на этуроль является белок Sup45, физически взаимодействующий с Sup35 в ходетерминации трансляции (Zhouravleva et al., 1995). Действительно, увеличениеэкспрессии SUP45 частично снимает токсичность, вызванную прионом [PSI+](Derkatch et al., 1998). При этом данные о присутствии Sup45 в прионных агрегатах53весьма противоречивы: в ряде исследований получены результаты в пользу этогопредположения (Paushkin et al., 1997; Czaplinski et al., 1998; Vishveshwara et al., 2009;Pezza et al., 2014), однако есть работы, свидетельствующие об обратном (Patino et al.,1996; Eaglestone et al., 1999).Феномен прионной токсичности прионов у дрожжей представляет собойудобную систему для изучения амилоидов и прионов in vivo.
Сверхэкспрессия SUP35токсична как для штаммов [PSI+] (Chernoff et al., 1992), так и для штаммов [psi-][PIN+](Derkatch et al., 1997), что обусловлено возникновением [PSI+] de novo. Этот фактпослужил основой для скрининга, который позволил идентифицировать эндогенныеи экзогенные факторы, влияющие на формирование приона и его токсичность(Tyedmers et al., 2008).1.2.3.3. Тест-система синтетической летальности фактора [PSI+] вкомбинации с мутациями sup45В ряде работ было показано, что фактор [PSI+] приводит к гибели гаплоидныхштаммов, несущих некоторые мутации sup35 или sup45 (Liebman and All-Robyn 1984;All-Robyn et al. 1990). Сходный летальный эффект наблюдали при совмещении вгаплоидном штамме мутаций sup35 и sup45 (Инге-Вечтомов и Андрианова., 1970), авпоследствии было показано, что супрессорные мутации sup35 и sup45 не способнысосуществовать в гаплоидных клетках, а иногда и в диплоидных гетерозиготах(Тиходеев, 1990).
Вследствие этого несовместимость [PSI+] и мутаций sup35 и sup45,вероятно, связана с нарушениями в терминации трансляции. На основании этогофеномена в лаборатории физиологической генетики была разработана тест-системасинтетической летальности [PSI+] и мутаций sup45, позволяющая идентифицироватьфакторы, влияющие как на нонсенс-супрессию, так и на свойства приона [PSI+](Kiktev et al., 2007).541.3. Цель и задачи исследованияЦелью данной работы является поиск и изучение новых генов дрожжейSaccharomyces cerevisiae, влияющих на синтетическую летальность приона [PSI+] смутациями sup45. В рамках цели были сформулированы следующие задачи:1. Идентифицировать новые гены, влияющие на синтетическую летальность cпомощью ранее разработанной тест-системы с использованием скрининга геномнойбиблиотеки;2.
Установитьвозможныемеханизмывлияниягенов-кандидатов,идентифицированных при этом скрининге;3. Проанализировать транскрипционнуюрегуляциюгенов,кодирующихфакторы терминации трансляции;4. Изучить влияние системы клеточных шаперонов на поддержание прионовдрожжей.552. Материалы и методыШтаммыШтаммы S. cerevisiae, использованные в данной работе, приведены в таблице 3.В работе использованы изогенные производные штамма S. cerevisiae 74-D694 (MATaade1-14(UGA) trp1-289(UAG) ura3-52 his3-∆200 leu2-3,112) [Chernoff et al., 1995].Штаммы OT56 и OT55 описаны ранее [Derkatch et al., 1997 // Genetics; Newnam et al.,1999 // Mol Cell Biol.]. Штамм 1-OT56 - [psi-][PIN+] вариант, полученный путёмсверхэкспрессии HSP104 с плазмиды pGPD-HSP104 в штамме OT56 с последующейпотерей плазмиды.
Штамм 2-OT56 - [psi-][pin-] вариант, отобранный послетрёхкратного пассирования 1-OT56 на среде с 4мM хлоридом гуанидина.Таблица 3. Штаммы S. cerevisiaeШтаммOT56OT551-OT562-OT56L-1A-D1628105L-1A-D1628107L-1A-D1628113L-1A-D1628115L-1A-D1628U-1A-D1628105U-1A-D1628107U-1A-D1628113U-1A-D1628115U-1A-D1628ГенотипMATa ade1-14 trp1-289 his3-Δ200 leu2-3,112ura3-52 [PSI+]S [PIN+]MATa ade1-14 trp1-289 his3-Δ200 leu2-3,112ura3-52 [PSI+]W [PIN+]MATa ade1-14 trp1-289 his3-Δ200 leu2-3,112ura3-52 [psi-] [PIN+]MATa ade1-14 trp1-289 his3-Δ200 leu2-3,112ura3-52 [psi-] [pin-]MATα ade1-14 trp1-289 his3 lys2 ura3-52leu2-3,112 sup45::HIS3MX [pRS315-SUP45]MATα ade1-14 trp1-289 his3 lys2 ura3-52leu2-3,112 sup45::HIS3MX [pRS315-sup45-105]MATα ade1-14 trp1-289 his3 lys2 ura3-52leu2-3,112 sup45::HIS3MX [pRS315-sup45-107]MATα ade1-14 trp1-289 his3 lys2 ura3-52leu2-3,112 sup45::HIS3MX [pRS315-sup45-113]MATα ade1-14 trp1-289 his3 lys2 ura3-52leu2-3,112 sup45::HIS3MX [pRS315-sup45-115]MATα ade1-14 trp1-289 his3 lys2 ura3-52leu2-3,112 sup45::HIS3MX [pRS316-SUP45]MATα ade1-14 trp1-289 his3 lys2 ura3-52leu2-3,112 sup45::HIS3MX [pRS316-sup45-105]MATα ade1-14 trp1-289 his3 lys2 ura3-52leu2-3,112 sup45::HIS3MX [pRS316-sup45-107]MATα ade1-14 trp1-289 his3 lys2 ura3-52leu2-3,112 sup45::HIS3MX [pRS316-sup45-113]MATα ade1-14 trp1-289 his3 lys2 ura3-52leu2-3,112 sup45::HIS3MX [pRS316-sup45-115]56Ссылка(Derkatch et al.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
