Диссертация (1145681), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Однако, in vivo не наблюдалось влияния нарибосомный сдвиг рамки считывания -1 или +1 или на нонсенс-супрессию. Обычночувствительность к аминогликозидам коррелирует с измененной точностьютрансляции, однако, возможно, эффект конкретно это этой аллели специфичен длянеправильного встраивания. Отбор in vivo большего числа мутантов, которыедемонстрируют дефекты точности, может помочь ответить на этот вопрос.1.1.2.3.
Компоненты рибосомыРибосома играет центральную роль в точности трансляции. И рРНК, ирибосомальные белки, а также факторы, взаимодействующие с рибосомой, могутвлиять на точность трансляции. Выявление функций эукариотических рибосом спомощью генетического подхода способствовало пониманию того, какие областиэтого аппарата вовлечены в поддержание точности (Chernoff et al., 1994; Wai et al.,272000).рРНК играет ключевую роль в точности.
Для изучения точности быловыделено и изучено множество мутаций малой субъединицы 18S рРНК. Среди нихмутации rdn2 (G517A), rdn4 (U912C), rdn12A (C526A) являются антисупрессорами,подавляющими сквозное прочтение стоп-кодона, опосредованное [PSI+], sup35-R8ts,sup45-R2ts или воздействием паромомицина (Chernoff et al., 1994; Velichutina et al.,2001). Важно отметить, что супрессия сквозного прочтения стоп-кодона в штаммах[PSI+] происходит не за счет излечивания приона. В соответствии с увеличеннойточностью в А-сайте, rdn4, rdn6 и rdn8 увеличивают точность декодирования тРНК invitro и in vivo (Chernoff et al., 1996; Liebman et al., 1995; Velichutina et al., 2000;Velichutina et al., 2001).
Нуклеотид 1054 в спирали 34 18S рРНК дал сериюинтересных мутантов с удивительно разнообразной точностьюМутации rdn1A (C1054A) и rdn1G (C1054G) вызывают доминантнуюнонсенс-супрессию и сильно чувствительны к паромомицину (Chernoff et al., 1996), втовремякак,неожиданнымобразом,мутацияrdn1T(C1054T)являетсяантисупрессором штаммов [PSI+], sup45-R2ts и sup35-R8ts, как и специфической дляUAA супрессии, вызванной мутацией глутаминовой тРНК, которая декодирует UAA(SLT3) (Chernoff et al., 1996; Liebman et al., 1995; Velichutina et al., 2000; Velichutina etal., 2001). rdn15 (A1491G) была обнаружена как супрессор Ts- дефекта роста умутанта sup45-R2ts.
Этот мутант лишь слегка уменьшал опосредованную sup45-R2tsнонсенс-супрессию; таким образом, эти два фенотипа не всегда связаны. Мутацияrdn15 частично компенсирует инактивацию eRF3, вызванную [PSI+], и, в отличие отслучая с sup45-R2ts, она подавляет и фенотип ts–, и фенотип нонсенс-супрессии умутантов sup35-R8ts. Возможно, rdn15 уменьшает трансляционную паузу настоп-кодоне, позволяя, таким образом, eRF1 распознавать стоп-кодоны болееэффективно (Palmer et al., 1979; Singh et al., 1979; Velichutina et al., 2001).Мутации в 25S рРНК, как и в 18S рРНК, влияют на точность трансляции.Мутация rdn5 (C3022U) находится в сарцин-рициновом домене, универсальной28консервативной структуры типа «стебель-петля» (Moazed et al., 1988; Brigotti et al.,1989), которая, как было показано, играет важную роль в связывании факторовэлонгации.
Эта мутация, логичным образом, может использоваться для анализа связифакторов eEF и рибосомы. Мутант rdn5 демонстрирует множество нарушенийточности: супресия некольких стоп-кодонов и непрограммируемая инсерция +1,устойчивость к аминогликозидам паромомицину, G418 и гигромицину (Burck et al.,1999; Liu & Liebman, 1996). Если основываться на связи с факторами элонгации, этамутация, возможно, вызывает уменьшенное сродство к факторам терминации, в тоже время усиливая способность «неподходящих» тРНК декодировать кодон А-сайта.Другой рРНК большой субъединицы, для которой было показано влияние натранляционную точность, является 5S рРНК, которая располагается на большойсубъединице 60S.
5S рРНК изначально связывали с точностью, когда былаидентицирована мутация mof9 (Dinman & Wickner, 1995). Затем был предпринятдетальный мутагенез 5S рРНК (Smith et al., 2001). Этот анализ показал, что 44 из 239протетированных аллелей 5S рРНК подавляли мутацию ade2-1(UAA), а 47 из 223подавляли мутацию can1-100(UAA). Предполагается, что одной из основныхфункций 5S рРНК может быть усиление точности трансляции за счет того, что онадействуеткакфизическийпередатчикинформациимеждуразнымифункциональными центрами рибосомы.В дрожжах, большинство протестированных рибосомных белков, как былопоказано, важны для функции рибосомы. Ряд данных показывает, что, хотя восновном рРНК занимает центр точности рибосомы, белки также играют роль в этоми сохранились консервативными в ходе эволюции (Alksne et al., 1993; см. Liebman etal., 1995). Поскольку декодирование происходит в малой субъединице, много белковмалой субъединицы также вовлечены в процесс контроля качества в ходетрансляции.Мутантные аллели sup44-1, suf14-1, sup46-2 в генах, кодирующих Rps2, Rps3 иRps9B, соответственно, сообщают устойчивость к паромомицину и подавляют серию29мутаций с инсерцией +1 и нонсенс-мутаций (Hendrick et al., 2001; Eustice et al., 1986;Masurekar et al., 1981; All-Robyn et al., 1990; Vinsent & Liebman; 1992).Интересно, что Rps28 может изменять точность трансляции в обоихнаправлениях.
Например, rps28-5 (G8C) является супрессорной мутацией, в то времякак rps28-12 (A113V) является антисупрессорной мутацией (Anthony & Liebman,1995). Различные мутации rpS28 (K62N, K62T, K62Q), как было показано,уменьшают чувствительность к паромомицину и демонстрируют антисупрессорныйэффект против омнипотентных супрессорных аллелей SUP44 (Rps2) и SUP46 (Rps9B)(Alksne et al., 1993).Недавние исследования показали, что рибосома принимает активное участие впроцессах укладки и стабильности синтезированных белковых цепей, и определяетсудьбу аберрантных мРНК и белков (Archer et al., 2016). Кроме того, рибосомапретерпевает ряд конформационных изменений в ходе терминации трансляции (см.Brown et al., 2015; Bulygin et al., 2016).1.1.2.4.
Системы регуляции стабильности мРНКВажным аспектом экспрессии генов являются системы контроля качества,которые распознают и деградируют дефектные мРНК (см. Doma & Parker, 2007; Isken& Maquat, 2007). Некоторые системы контроля качества мРНК деградируют мРНК,дефектные в трансляции. Например, система Nonsense-Mediated Decay (NMD)быстро деградирует мРНК с преждевременными стоп-кодонами (Maquat, 2004).Сходным образом, система Nonstop Decay (NSD) находит усеченные мРНК, которыене содержат кодонов терминации и подвергает их быстрой 3’-5’-деградаии спомощью экзосомы (Frischmeyer et al., 2002; van Hoof et al., 2002).Третий путьконтроля качества трансляции, система No-Go decay (NGD), действует в ходе этапаэлонгации при синтезе белка и направлена на РНК с застрявшей рибосомой (Doma &Parker, 2006).
NMD опосредован факторами Upf1, Upf2 Upf3, все из которыхнапрямую взаимодействуют с eRF3; при этом из них только Upf1 взаимодействует с30eRF1 (Czaplinski et al., 1998; Wang et al., 2001).UPF1 является ключевым эффектором NMD, при этом UPF2 и UPF3регулируют его функцию UPF1. Это заключение следует из биохимического анализа,показывающего, что для максимальной АТФазной активности UPF1 in vitroнеобходимы как UPF2, так и UPF3 (Chamieh et al., 2008), и сверхэкспрессия UPF1может компенсировать мутации в UPF2 и UPF3, но не наоборот (Maderazo et al.,2000).Ряд исследований показал, что положения нонсенс-кодонов влияют наинтенсивность NMD.
Чем ближе нонсенс-кодон к 5’-концу, тем выше скоростьраспада транскрипта; мРНК имеет тенденцию к деградации скорее за счёт NMD, чемза счёт распада, зависимого от деаденилирования (Cao et al., 2003; Wang et al., 2002).Позже было обнаружено, что длина 3’-нетранслируемой области участвует в запускеNMD; расстояние между терминирующим кодоном и polyА-хвостом важно дляопределения того, будет ли мРНК деградирована с помощью NMD или за счётраспада, зависимого от деаденилирования (Buhler et al., 2006) (это не тольколинейная длина РНК, так как РНК формирует вторичные и третичные структуры).Это мнение поддерживается тем наблюдением, что связывание с PABP около PTCподавляет NMD (Ivanov et al., 2008; Silva et al.,2008; Eberle et al., 2008).
Интересно,что PABP был идентифицирован как фактор, антагонистичный NMD (Singh et al.,2008). Мотив eRF3PAM2, который используется для взаимодействия с PABP, такжеиспользуется для взаимодействия с Upf1, и Upf1 соревнуется с PABP за связывание сeRF3. Таким образом, расстояние между терминирующим кодоном и polyА-хвостом,другими словами, взаимодействие между eRF3 и PABP, важно для определения того,будет ли мРНК деградирована с помощью NMD или за счёт распада, зависимого отдеаденилирования: если это расстояние достаточно большое для того, чтобынарушить взаимодействие между eRF3 и PABP, Upf1 вместо PABP связывается сeRF3,изапускаетсяNMD(терминирующийкодонраспознаётсякакпреждевременный), а если это расстояние позволяет взаимодействовать eRF3 and31PABP, терминирующий кодон распознается как истинный, и запускается распад,зависимый от деаденилирования.Однако, у дрожжей было обнаружено, что Upf1 подавляет связывание Pab1(PABP у дрожжей) с eRF3, в то время как на взаимодействие между Upf1 и eRF3 Pab1практически не влияет (Kervestin et al., 2012), а Pab1 и polyA-хвост не необходимыдля NMD (Meaux et al., 2008).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
