Диссертация (1145681), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Наиболее полно описать механизм распознавания стоп-кодонов сталовозможно лишь недавно, после моделирования терминационного комплекса наоснове данных криоэлектронной микроскопии с высоким разрешением 3,5 – 3,8A˚(Brown et al., 2015). Оказалось, что мРНК компактизована таким образом, что вA-сайте оказываются не 3, а 4 нуклеотида, благодаря тому, что 4-й нуклеотидформирует стэкинг-пару с основанием G626 из 18S рРНК.
Бóльшая стабильностьэтого взаимодействия между двумя пуринами, чем между G и пиримидинамиобъясняет повышенную эффективность терминации, когда за стоп кодоном следуетпурин, и бóльшую встречаемость таких терминирующих тетрануклеотидов уэукариот (Brown et al., 1990; Tate et al., 1995; Bonetti et al., 1995). Подтвердилосьпредположение о том, что последовательность NIKS связывается с уридином в 1-мположении стоп-кодона (Рис.
2А), а Y и С из мотива YxxCxxxF (Рис. 2Б) и T32(указан номер а-к из eRF1 Homo sapiens, соответствует T29 в Sup45 S. cerevisiae) изGTS – с пуринами во 2-м и 3-м положении, причём в случае UGA изменениеконформации N-домена приводит к неспособности T32 взаимодействовать состоп-кодоном.Наконец,выяснилось,почему13кодонтриптофана(UGG)несчитывается eRF1 в качестве стоп-кодона: ключевую роль здесь играет остаток E55(E52 в Sup45), который способен формировать водородную связь только саденозином во 2-м и/или 3-м положении стоп-кодона (Рис. 2В; см.
Brown et al., 2015).Рисунок 2. Распознавание стоп-кодонов фактором eRF1. А. Связывание мотива NIKS с U в1-м положении стоп-кодона. Б. Связывавние Y и C из мотива YxxCxxxF со 2-м и 3-мнуклеозидами стоп-кодона UAG. В. Взаимодействие E55 с тремя типами стоп-кодонов и скодоном UGG. По Brown et al., 2015.N и M-домены eRF1 связываются с тРНК в P-сайте рибосомы: одна изα-спиралей N-домена связывается с антикодоновой петлёй, а центральный,M-домен – с пептидил-трансферазным центром с помощью петли GGQ (Brown et al.,2015). M-домен является структурно-функциональным аналогом акцепторногостебля тРНК и главной его функцией является гидролиз пептидил-тРНК. Основная14роль в этом процессе отводится консервативный мотиву GGQ, который, по-видимому,ориентирует молекулы воды для осуществления гидролиза (Frolova et al., 1999; Songet al., 2000).
Аминокислотные замены в GGQ летальны для дрожжей (Song et al.,2000). Кроме того, замены в GGQ могут приводить к снижению связывания eRF1 cрибосомой (Seit-Nebi et al., 2001), а замены в соседних с ним остатках аргининов – кснижению ГТФазной активности eRF3 (Cheng et al., 2009), что говорит о возможнойроли M-домена eRF1 и в этих процессах.С-концевой домен eRF1, отвечает за связывание фактора eRF1 с такжеС-терминальным доменом eRF3 (Stansfield et al., 1995; Zhouravleva et al., 1995; Ito etal., 1998; Merkulova et al., 1999). Анализ активности фрагментов eRF1 и eRF3 in vivoпоказал, что для взаимодействия eRF1 c eRF3 млекопитающих необходимы участки281-305 и 411-415 а-к. Второй из этих участков необходим также для стимулированияГТФазной активности eRF3 (Merkulova et al., 1999).
У дрожжей путём анализамутантов, полученных с помощью последовательных делеций аминокислот наС-конце eRF1, был выявлен участок, непосредственно взаимодействующий с eRF3(а-к. 411-418). Кроме этого показано, что делеция 32 аминокислот на С-конце eRF1 S.cerevisiae летальна для клетки, в то время как делеция 19-ти аминокислот приводит кнарушению терминации in vivo, которая проявляется в повышении уровнянонсенс-супрессии.
В состав С-домена eRF1 входят также участки взаимодействия срибосомой (Eurwilaichitr et al., 1999).1.1.1.2. Фактор eRF3 (Sup35)У дрожжей фактор терминации II класса eRF3 кодируется жизненно важнымгеном SUP35. Белок eRF3 так же состоит из трёх доменов: N, M и C. Границы междудоменами соответствуют положению трёх кодонов ATG (включая старт-кодон),находящихся в одной рамке считывания в гене SUP35 (Kushnirov et al., 1988).
Вотличие от N и M доменов, С домен является жизненно важным для клетки инеобходим для нормального прохождения терминации трансляции (Ter-Avanesyan et15al., 1993; Zhouravleva et al., 1995). С-домен eRF3 гомологичен фактору элонгациитрансляции eEF1F и высоко консервативен у эукариот, в то время как N и M-доменыконсервативными не являются (Zhouravleva et al., 2002). С-домен eRF3 способенсвязываться с С-концевым районом eRF1 с образованием прочного комплекса in vivo(Eurwilaichitr et al., 1999).
Как и в eRF1, два участка С-домена eRF3 необходимы длявзаимодействия этих факторов, а именно 478-530 и 628-637 а-к (Merkulova et al.,1999). Так как белок eRF3 обладает ГТФазной активностью только в присутствииeRF1, по-видимому, взаимодействие eRF1 и eRF3 приводит к изменениюконформации eRF3, что приводит к активации его ГТФазной активности (Frolova etal.,1996).Cпомощьюрентгеноструктурногоанализаудалосьустановитьтрехмерную структуру С-терминального домена eRF3 из Schizosaccharomyces pombe(Kong et al., 2004) и подразделить его на три субдомена: ГТФ-связывающий(G-домен), домен II и домен III, содержащий участки связывания eRF1.Функции N-концевого домена до конца не ясны, но известно, что онспецифически взаимодействует с polyA-связывающим белком Pab1 (Hoshino et al.,1999; Cosson et al., 2002).
Показано также, что делеция N-домена приводит кувеличению времени полужизни различных матричных РНК клетки и одновременно,к удлинению polyA (Hosoda et al., 2003). Таким образом, N-домен можетфункционировать в посттрансляционной деградации РНК. Известно также, чтоN-доменSup35необходимдлявзаиможействиясPub1иформированиятубулин-ассоциированного комплекса (Li et al., 2014).
Оба взаимодействия могутбыть консервативными, так как показано, что гомологи Sup35 млекопитающих такжевзаимодействуют с соответствующими гомологами Pab1 и Pub1 (Cosson et al., 2002;Lietal.,2014).НонаиболееизученнойявляетсярольN-доменакакприонообразущего для дрожжевого фактора [PSI+], структурным белком которогоявляется Sup35 (см. раздел 1.2.1.2).161.1.1.3. Другие компоненты аппарата терминации трансляцииСравнительно недавно удалось идентифицировать эукариотический фактор,который, подобно бактериальному RRF, осуществляет бы разборку терминационногокомплекса, разъединяет субъединицы рибосомы и способствует её рециклизации .В последующих исследованиях, проводимых несколькими группами, былидентифицирован многофункциональный белок ABCE1 из семейства ABC.
Он былобнаружен у эукариот и архей и является вероятным кандидатом на роль белка,способствующего рециклизации рибосомы (Pisarev et al., 2010; Barthelme et al., 2011).Эта цитоплазматическая АТФаза высококонсервативна у эукариот (Kerr, 2004; Dean& Annilo, 2005) и является необходимой для всех исследованных организмов (Dong etal., 2004; Zhao et al., 2004; Andersen & Leevers, 2007). ABCE1 (или Rli1 у дрожжей)является цитоплазматической АТФазой из семейства ABC, содержащей двануклеотид-связывающих домена и консервативный N-терминальный [4Fe-4S] домен,необходимый для её функции (Barthelme et al., 2011, Barthelme et al., 2007,.
Karcher etal., 2005, Karcher et al., 2008). Rli1 взаимодействует с факторами терминациитрансляции как in vitro, так и in vivo (Pisarev et al., 2010, Khoshnevis et al., 2010).Соответственно, eRF1 необходим для опосредованной Rli1 рециклизации рибосомпослетерминации(Pisarevetal.,2010).Болеетого,экспериментыснонсенс-супрессией показали, что сверхэкспрессия Rli1 способна компенсироватьнеэффективную терминацию, вызванную определёнными мутациями факторовтерминации,хотяостаетсянеизвестным,происходитлиэтоблагодарярециклизующей активности Rli1 или другой активности (Khoshnevis et al., 2010).Хотя факторы терминации действуют только в контексте стоп-кодона, в несколькихисследованиях показано, что Pelota и ABCE1 (человеческие ортологи Dom34 и Rli1,соответственно) вовлечены в разъединение пустых субъединиц рибосом 80S илирибосом, застрявших на 3’-конце мРНК (Pisareva et al., 2011, Kobayashi et al., 2010,Bhattacharya et al., 2010).
У дрожжей, однако, показано, что комплекс Dom34 и Hbs1способен разъединять субъединицы без Rli1 (Shoemaker et al., 2010). Соответственно,17остаётсяневыясненнымрядважныхвопросов,касающихсяважностивзаимодействий комплексов Dom34 и Hbs1 или eRF1 и eRF3 с Rli1.Хотя канонические факторы терминации, как оказывается, обладают некоторойвнутренней способностью к рециклизации рибосом, добавление Rli1 к этой реакциисущественно увеличивает скорость наблюдаемой реакции in vitro (Pisarev et al., 2010;Shoemaker & Green, 2011), и эта активность зависит от гидролиза АТФ. Так какABCE1/Rli1 относится к семейству АТФаз ABC, предполагается, что он каким-либообразом конвертирует химическую энергию гидролиза АТФ в механическиедвижения, которые могут разделять субъединицы. Помимо роли в рециклизации, дляRli1 также было показано, что он напрямую увеличивает скорость высвобожденияпептида комплексом eRF1 и eRF3, независимым от гидролиза АТФ способом(Khoshnevis et al., 2010; Shoemaker & Green 2011).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
