Диссертация (1145681), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Однако, учитывая особенности этих исследований, былосложно судить об относительных частотах встраивания или заключить, что те жесамые тРНК могут быть вовлечены в сквозное прочитывание in vivo. Более того,низкоеколичествочувствительнымипродуктаспособамисквозногодетекции,прочитывания,могливместезатруднитьсменееидентификациювстраиваний редких аминокислот, как и в случае с исследованием, посвщеннымвстраиванию на месте UAA. В недавнем исследовании на S. cerevisiae былипредприняты попытки исследовать эти вопросы in vivo (Blanchet et al., 2014).
Однако,для того, чтобы обеспечить максимальный выход продукта сквозного прочитывания,в этом исследовании были скомбинированы два разных условия, стимулирующихсквозное прочитывание (upf1Δ и [PSI+]). Хотя этот подход помог идентифицироватьвстраивание трех различных аминокислот на местах всех трех PTC, интерпретацияэтих результатов не была четкой, поскольку частоты встраиваний отражали эффектытрех независимых событий сквозного прочитывания: эндогенного сквозногопрочитывания, делеции UPF1 и дефекта в eRF3. В другом недавнем исследованиибыли изучены частоты встраивания аминокислотных остатков на места всех трёхстоп кодонов как в клетках дикого типа, так и в условиях повышеннойнонсенс-супрессии, вызванной [PSI+], мутацией sup45 или делециями генов23компонентов NMD (Roy et al 2015).1.1.2.2.
Компоненты инициации и элонгации трансляцииПосле инициации, три белковых комплекса, которые гидролизуют ГТФ (eEF1 иeEF2) или АТФ (eEF3) играют ключевые роли в эффективном и точном синтезе белка.Гидролиз нуклеотидов у всех трех eEF стимулируется при их взаимодействии срибосомой. Факторы элонгации влияют на поддержание правильной рамкисчитывание, правильное расположение аминокислот и точное распознаваниестоп-кодона.Все аминоацил-тРНК, за исключением инициирующей метиониновой тРНКдоставляются к рибосоме с помощью eEF1A. Предполагается, что существует этап«кинетическойкоррекции»дляправильногоразмещения«подходящей»аминоацил-тРНК в А-сайте с помощью eEF1A (Hopfield, 1974; Burgess & Guthrie,1993).
Он включает в себя доставку аминоацил-тРНК фактором eEF1A к А-сайту вГТФ-зависимой манере. При правильном взаимодействии кодона и антикодонапроисходитгидролизГДФ,аминоацил-тРНКвысвобождаетсяизeEF1A иразмещается в А-сайте. Кристаллическая структура дрожжевого белка eEF1A вкомплексе с фактором обмена гуанинового нуклеотида eEF1Ba (Andersen et al., 2000)позволила проверить модели для ролей нуклеотидов и аминоацил-тРНК впредоставлении сигналов, которые обеспечивают точный синтез белка.
Она такжепривела к созданию модели для роли домена II фактора eEF1A в связыванииаминоацил-тРНК (Andersen et al., 2000).Центральная роль eEF1A в доставке аминоацил-тРНК делает его важнымкомпонентом системы поддержания точности в клетке. Дрожжевой eEF1Aкодируется двумя генами, TEF1 и TEF2, которые имеют идентичные кодирующиеобласти. Ключевая роль гидролиза ГТФ в сигналинге правильного взаимодействиякодона и антикодона позволяет предсказать, что мутации, влияющие на связывание игидролиз нуклеотида будут также влиять на точность. Замена N153T в связывающем24ГТФ-связывающемконсенсусномэлементеNKXDувеличиваетчастотунеправильного встраивания лейцина, измеренную in vitro в экспериментах сполиурациловыми последовательностями, в 2,3 раза, в то время как заменыN153T/D156E и D156N демонстрируют изменения в 1,5-1,9 раза (Cavallius & Merrick,1998).
In vitro мутант N153T демонстрирует 4,6-кратное увеличение внутреннейГТФазной активности. Поскольку декодирование и терминация происходят в А-сайте,мутации, которые влияют на один процесс, могут также влиять и на другой (Song etal., 1989). In vivo, мутанты в ГТФ-связывающем консенсусном элементе NKXDдемонстрировали четырёхкратно увеличенную омнипотентную нонсенс-супрессию(сквозное прочитывание всех трех стоп-кодонов) (Carr-Schmid et al., 1999).Остается неясным, происходит ли нонсенс-супрессия полностью благодарянеправильному прочитыванию или же является результатом прямого воздействия напроцесс терминации.
Мутации NKXD влияют как на неправильное прочитывание,так и на нонсенс-супрессию. Исследования также показали, что уменьшениеколичества генов eEF1A с двух копий до одной к увеличению точности притерминации на нонсенс-мутациях (Song et al., 1989).Функцией eEF1Ba в клетке является регуляция активности eEF1A за счеткатализавысвобожденияГДФвобменнаГТФ.Еслиопиратьсянакокристаллическую структуру дрожжевого eEF1A и каталитического фрагментаeEF1Ba (Andersen et al., 2000), становится ясно, что мутации в eEF1Ba ведут себяпо-разному в зависимости от тог, взаимодействуют ли они с доменом I (связываниеГТФ) или с доменом II (связывание аминоацил-тРНК).
Анализ 21 аллели в остатках120-122 eEF1Ba (Carr-Schmid et al., 1999) продемонстрировал антисупрессию всехтрех стоп-кодонов. Анализ остатка F163 в eEF1Ba позволил предположитьперекрывание аминоацильной части аминоацил-тРНК с доменом II и, с другойстороны, дал совсем другие результаты. Хотя штамм, экспрессирующий мутациюF163A,демонстрируетзамедленныйрост,сниженныескороститотальнойтрансляции и чувствительность к ингибиторам элонгации трансляции, влияния на25нонсенс-супрессию не наблюдается (Andersen et al., 2000). Отсутствие корреляциимежду уменьшенной тотальной трансляцией и измененной точностью у мутантовeEF1Ba говорит о том, что нонсенс-супрессия не является результатом замедленнойэлонгации.
Необходим дальнейший анализ для выяснения того, влияет ли eEF1Ba наточность через eEF1A или через другой механизм.Во всех эукариотических организмах, изученных к настоящему времени,eEF1Ba ассоциирован с субъединицей eEF1g. У дрожжей гены, кодирующие eEF1Bg,TEF3 (CAM1) и TEF4, не являются необходимыми (Kinzy et al., 1994). Как и дляeEF1A,уровниeEF1Bgмогутвлиятьнаточностьпроцессатрансляции.Сверхэкспрессия гена TEF4 приводит к уменьшенному сквозному прочитываниюстоп-кодона (Benko et al., 2000).
Этот фенотип сходен с эффектом мутаций eEF1Ba накаталитическую поверхность белка. Делеция обоих аллелей eEF1Bg приводит кпочти двухкратному увеличению нонсенс-супрессии. Таким образом, хотя eEF1Bg ненеобходим in vivo, он может помочь изменять активность eEF1Ba и, в результате,влиять на нонсенс-супрессию (Valente & Kinzy, 2003). Кроме того, показано, чтосверхэкспрессия TEF3, TEF4 и TEF5 снижает вероятность прочитывания стоп-кодонов в системелетального взаимодействия мутаций sup45-sl23ts и SUP35-C (Valouev et al, 2009).Перенос пептидил-тРНК из гибридного сайта P/A к сайту P за счёт eEF2 такжеможет быть причиной ошибок элонгации.
eEF2 катализирует ГТФ-зависимыйперенос пептидил-тРНК, и мРНК продвигается на следующие три основания,помещая следующий кодон в А-сайт (см. Merrick & Nyborg, 2000; Noller et al., 2002;Ramakrishnan, 2002).Связь между eEF2 и точностью трансляции известна из работ, связавшихингибиторы пептидилтрансфераз с измененными уровнями сдвига рамки считывания(Dinman et al., 1997, Dinman et al., 1998). Среди веществ, влияющих на процесс PRFприсутствуют анизомицин, преуссин и спарсомицин для сигнала -1 и сордарин длясигнала +1 (Dinman et al., 1997; Kinzy et al., 2002; Pestka et al., 1977, Peltz et al., 1999;Harger et al., 2001).26Уникальный и необходимый белок eEF3 использует АТФ, в отличие от другихфакторов элонгации eEF1 и eEF2, которые обладают зависимыми от рибосомГТФазными активностями.
Существуют подтверждение того, что у прокариот естьпредположительный eEF3-подобный белок (Kiel et al., 1999). У высших эукариот неттакого гомолога, хотя рибосомы у Metazoa имеют собственную АТФазнуюактивность (Rodnina et al., 1994; Kovalchucke & Chakraburtty, 1994; El’skaya et al.,1997) и eEF3 необходим в рибосомах дрожжей, но не Metazoa (Skogerson et al., 1977).Это привело к созданию моделей, в которых eEF3 или его предполагаемая функциявысвобождениявE-сайтедеацетилированнойтРНКиаллостерическихвзаимодействий с функцией А-сайта были позднее встроены в рибосому (Belfield etal., 1995). In vitro eEF3 стимулирует доставку «подходящей» аминоацил-тРНКфактором eEF1A, находящейся в предпочтении по сравнению с «неподходящей»аминоацил-тРНК (Uritani & Miyazaki, 1988), позволяя, таким образом, предположить,связь с точностью трансляции in vivo. Температурочувствительный (ts-) мутант,дефектный по АТФазе eEF3 (F650S) демонстрирует повышенную чувствительность каминогликозидам (Anand et al., 2003).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
