Диссертация (1145681), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Праймеры, использованные в работе№НазваниеПоследовательность (5’ - 3’)175CACTATCGACTACGCGATCA61YEp13176CGCCAGCAACCGCACCTGTYEp13Hlj1_out-SalI_fAAACGTCGACCTCGACACTCCTAHLJ1Hlj1_out_PstI_rCACACTGCAGTAAAGACAGTATTGGCHLJ1MCM1-F-BamHICCACGGATCCAAAATGTCAGACATCGAAGAAGGTMCM1A#415#416#417#418#419#420#736#737#739#740#743#744mcm1MC-F-BamHIGGATCCATAATGACGCAGCAGGAAGGTAGAAMCM1MCM1-R-SacIAATCGGAGCTCTTAGTATTGGCCTTGTTGCGGTTMCM1cur1dN(-NLS)-F-EcoRIcur1dN(+NLS)-F-EcoRIcur1dN(SalI)-F-EcoRIcur1dC(SalI)-R-XhoIcur1dN(STS)-F-EcoRIcur1dC(dSTS)-R-XhoIEXFP-F-BamHIAGAGAATTCCAACAGCCGCAACTACGTCCACCCCTTCCCAGAATTCATGATCCGCAAGAAAAGAAAAATACAACAGGGAAGAATTCGTCGACGAAAATAGGCTAACTTCTGAGTCTCTCGAGTTTACCTATTTTCGTCGACACTCTGTTCCACCAGGAATTCAGCGCCGTTAATAGGGTTTCAACATCTTTGTCTCGAGTTTAAACCCTATTAACGGCGCTATCATTCTGCGGTCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAEXFP-R-XbaIPcur1-R-EcoRIAGCCCTCTAGACTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCTGGGCCCTAGGAAATACGGGCTACGGAATTTACCGTAGCAGATCTTGGACCCCGCCCATTCAATCTTCTAAATGCAGAATTCAGCCATTAGTCAGTTTTCTERcur1-F-SalITTGAATGTCGACTAAGAAATACGGGCTACGGAF-Sfp1-Bgl2GCTTATAGATCTATGGATTTTACAACAATGRSFP1SAC1AGAGCTCTTAGTGAGTGGAGTGGCCRSFP1SAC2TTCTACCGCGGGTGAGTGGAGTGGCCCSfp1dC(fs636)-R-SacISUP45_FTCTGGAGCTCTTACGCTAATGTACCGTCAGGCGATCCAAGACTAGCATGTAAGpU-SFP1-GFPconstructionpU-SFP1ΔCconstructionqRT-PCRSUP45_RCTTGAACATACTTGACATTGGC–«–SUP35_FACAACAAGGTAACAACAGATACC–«–SUP35_RGGATTGAATTGCTGCTGATAAC–«–F1-SFP1-RTCAACAATGACTATGGCAAGC–«–TERcur1-F-XmaJICUR1end-R-BglII62pU-SFP1construction–«–R1-SFP1-RTGAAGGAGTATTCTGGTTCG–«–ACT1_FTAACGGTTCTGGTATGTGTAAAGC–«–ACT1_RGCTTCATCACCAACGTAGGAGTC–«–ОТ-ПЦРРВКультуры клеток для последующего выделения РНК выращивали при 30 °С вселективной для поддержания плазмид среде на основе YNB (Invitrogen).
Дляиндукции в среду добавляли CuSO4 до конечной концентрации 150 μM, после чегокультуру инкубировали до достижения середины логарифмической фазы роста(OD600=0.5-0.6). Выделение РНК для обратной транскрипции с последующейколичественной ПЦР в режиме реального времени (ОТ-ПЦРРВ) проводили сиспользованием набора реактивов GeneJET RNA Purification Kit (Thermo Scientific)согласно инструкции производителя. Для очистки препаратов РНК использовалинабор реактивов RapidOut DNA Removal Kit (Thermo Scientific). Синтез кДНКпроводили с использованием обратной транскриптазы RevertAid (Thermo Scientific)по протоколу производителя.
Для ОТ-ПЦРРВ использовали реакционную смесь скрасителем EVA Green (Синтол), оптически прозрачные пробирки (Bio-Rad) иамплификатор CFX96 (Bio-Rad). В качестве референса использовали критическийцикл амплификации ACT1. Последовательности праймеров приведены в таблице 5.Анализ данных проводили с использованием среды программирования R (R CoreTeam, 2014) и пакета reshape2 [Wickham, 2007]. Для сравнения значений изменениякритического цикла (∆Cq) в опытных и контрольных образцах использоваликритерий Вилкоксона-Манна-Уитни.Анализ белковКультуры клеток для последующего выделения белков выращивали при 30 °С вселективной для поддержания плазмид среде на основе YNB (Invitrogen).
Прииндукции экспрессии SFP1 под контролем промотора pCUP1, клетки растили в6380-100 мл среды до достижения OD600=0.3 для получения конечной культуры влогарифмической фазе, или OD600=0,6 для получения ранней стационарной культуры.Затем культуру делили на равные обьемы и в одну из проб добавляли CuSO4 доконечной концентрации 150 μM, после чего культуры инкубировали в течение 3часов. Часть культуры, в которую не добавляли CuSO4, использовали в качествеконтроля.
При использовании плазмиды pRS426-SFP1 для сверхэкспрессии SFP1клетки растили в 40 мл среды до достижения OD600=1,0, а в качестве контроляиспользовали трансформантов плазмидой pRS426. Клетки осаждали при 10 °С прискорости 7500 об/мин в течение 5 минут, после чего осадок замораживали при -80 °С.Выделение белка и подготовку проб для электрофореза белков в полиакриламидномгеле, содержащем додецилсульфат натрия (SDS-PAGE), проводили в соответствии состандартной методикой [Sambrook et al., 1989]. Перенос белков из геля на мембрануPVDF (Amersham) и вестерн-блот-гибридизацию проводили по стандартнойметодике [Towbin et al., 1979]. Использованные в работе антитела указаны в таблице6. Визуализацию вестерн-блотов проводили с помощью прибора GeneGnome(Syngene) c использованием набора реагентов ECL Select Western Blotting DetectionReagent(Amersham).Количественныйанализпроводилисиспользованиемпрограммы ImageJ [Schneider et al., 2012 // Nature Methods].Флуоресцентная микроскопияКультурувыращивалилогарифмическойфазывроста.жидкойПослеселективнойэтогоклеткисредепридосерединынеобходимостиконцентрировали центрифугированием при скорости не более 3000 об/мин.
Клетки вSC с добавлением 0,4 обьёма глицерина заключали в препараты с использованиемпредметных и покровных стёкол BioVitrum. Флуоресценцию анализировали спомощью микроскопа Zeiss Axioscope A1. Изображения получены с помощьюкамеры QIClick-F-CLR-12 (QImaging) и программы QCapture Pro.7.643. Результаты3.1. Скрининг геномной библиотеки, направленный на выявление новыхфакторов, влияющих на терминацию трансляцииВ данной работе был проведён поиск новых факторов, влияющих либо на[PSI+], либо на аппарат трансляции, и исследованы возможные механизмы, которыележат в основе влияния некоторых выявленных кандидатов.
Ранее было показано,что одновременное присутствие в клетке фактора [PSI+] и мутаций в гене SUP45может оказаться летальным для дрожжей. Это явление получило названиесинтетической летальности детерминанта [PSI+] с мутациями sup45 (далее –синтетическая летальность), и на его основе в нашей лаборатории была разработанаи применена тест-система синтетической летальности [PSI+] с мутациями sup45(далее – тест-система). Синтетическая летальность проявляется как отсутствие ростадиплоидных клеток с генотипом SUP45/sup45 [PSI+]. В тест-системе мыиспользовали штаммы, несущие нонсенс- и миссенс-мутации в гене SUP45 (Рис.
9,справа), часть из которых (sup45-102, -104, -105, -107) летальны при скрещивании соРисунок 9. Тест-система синтетической летальности и свойства использованных в работемутаций sup45. Слева направо: показан характер роста гибридов при скрещивании штаммов,производных 74-D694 (статус приона [PSI+] указан сверху) со штаммами 1А-D1628, несущимиуказанные аллели SUP45; далее, рост штаммов 1A-D1628 [sup45-x] на среде для цветной селекции(¼YEPD) и среде без аденина; справа – характеристика мутаций в гене SUP45 и продуцируемыхвариантов белка Sup45 у мутантов.
Пунктирной стрелкой обозначен полноразмерный белок,который в малых количествах также продуцируется у нонсенс-мутантов (см. Москаленко, 2003).65штаммом, несущим сильный вариант [PSI+]S (Рис. 9), две мутации (sup45-101, -116)значительно снижают жизнеспособность гибридов, а мутации sup45-113 и sup45-115не приводят к летальности (совместимы с [PSI+]S) (Kiktev et al., 2007) (Рис.
9).Данная тест-система была использована для проведения скрининга библиотекигенов S. cerevisiae, сконструированная на основе мультикопийного вектора YEp13.Схема первичного скрининга (Киктев и др., 2011) приведена на Рисунке 10. В ходескрининга библиотеки генов дрожжей, находящихся на мультикопийных плазмидах,былопроанализировано16650конструкций,былиотобраныконструкции,присутствие которых как подавляло рост диплоидов (усиливало синтетическуюлетальность), так и улучшало их рост (снижало синтетическую летальность).Конструкции, повлиявшие на синтетическую летальность далее выделяли издрожжей и анализировали повторно (вторичный скрининг).Рисунок 10. Схема проведения скрининга при помощи тест-системы синтетическойлетальности (по Киктев и др., 2011).66По результатам скрининга ранее уже были идентифицированы некоторые гены,влияющиенасинтетическуюлетальность.Этигены,атакжегены,идентифицированные в данной работе, приведены в таблице 7.Таблица 7.
Гены, обнаруженные при скрининге сверхэкспрессионной геномной библиотеки.ГенФункция белкаСинтетическаялетальностьСсылкаHSP104Hsp100, дезагрегаза↓Киктев и др., 2011RNQ1C? (нуклеация приформировании прионов)↓Киктев и др., 2011CUR1Cортинг шаперонов↑Киктев и др., 2011HLJ1Hsp40, ассоциированныйс мембраной ЭПР↑Матвеенко и др., 2013MCM1Транскрипционныйфактор↑Матвеенко и др., 2013TEF2Фактор элонгациитрансляции eEF1A↑Матвеенко и др., 2013Триптофановая тРНК↓Данная работаtW(CCA)G1В ходе данной работы нами были подробно проанализированы 15 конструкцийиз сверхэкспрессионной библиотеки генов, отобранные при первичном скрининге(Рис.
11, слева). В результате было выявлено 10 плазмид: присутствие 9-ти из нихусиливалосинтетическуюлетальность,аодной–снижало.Концевыепоследовательности вставок геномной ДНК были идентифицированы с помощьюсеквенирования. Поиск полученных последовательностей в базе данных генома S.cerevisiae с помощью алгоритма BLAST (www.yeastgenome.org/blast-sgd) позволилопределить гены и их фрагменты, присутствующие на плазмидах (Рис. 11, справа).67Рисунок 11. Результаты скрининга геномной библиотеки.
Слева – результаты скрещиванийштамма ОТ56, трансформированного плазмидами с указанными номерами, со штаммамиU-1A-D1628, несущими различные аллели SUP45. Справа – расположение генов на фрагментаххромосом S. cerevisiae, присутствующих на плазмидах геномной библиотеки.Вдальнейшейработемыболееподробноизучилимеханизмы,обуславливающие влияние генов CUR1, HLJ1, MCM1 и TEF2 на синтетическуюлетальность, а также рассмотрели эффект усиления экспрессии тРНКTrp. Ген CUR1был выявлен ранее при анализе результатов скрининга (Киктев и др., 2011;Архипенко, 2009). Мы обратили внимание на ген HLJ1, так как сразу две плазмиды,YЕp13-1825 и YЕp13-5618, содержат один и тот же участок хромосомы XIII,несущий гены YMR160W (ген с неизвестной функцией) и HLJ1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
