Диссертация (1145681), страница 15
Текст из файла (страница 15)
23Б). Таким образом, можносделать вывод, что при сверхэкспрессии SFP1 дополнительно продуцируемый Sup35преимущественно переходит в прионную форму, что сдвигает баланс междумономерным и агрегированным белком и может являться причиной прионнойтоксичности.АБРисунок 23. Сверхэкспрессия SFP1 приводит к усилению агрегации Sup35. Штамм OT56 былтрансформирован pRS426-SFP1 (↑↑Sfp1) или pRS426 (вектор); трансформантов растили додостижения OD600 = 1.0, после чего получали пробы белков.
Полученные лизаты анализировали спомощью дифференциального центрифугирования (А) или с помощью полуколичественногоSDD-AGE, совмещёенного с SDS-PAGE (Б). Представлены результаты вестерн-блот гибридизациис антителами против указанных белков. А. В гель наносили пробы тотального белка (Т), а такженадосадочной (Н) и осадочной (О) фракций.
Б. Анализировали серии трехкратных разведенийлизатов.823.4.6. Токсичность, вызванная SFP1, компенсируется сверхэкспрессиейSUP35C и SIS1, но не SUP45Известно, что токсичность [PSI+] компенсируется сверхэкспрессией SUP35Cили SUP45, Однако мы показали, что в случае, когда токсичность вызванасверхэкспрессией SFP1, сверхэкспрессия SUP35C, но не SUP45, компенсируеттоксчность (Рис.
24A). Появление избытка Sup45 и продукция Sup35C былипроверены с помощью вестерн-блот гибридизации (Рис. 24Б).Мы также проверили, влияет ли сверхэкспрессия SUP45 на усилениесинтетическойлетальностидополнительныекопиигенаприсверхэкспрессиидикогоSUP45типаSFP1.Известно,значительночтоослабляютсинтетическую летальность (Kiktev et al.
2007), что делает невозможным проведениетеста на синтетическую летальность при коэкспрессии SUP45. Поэтому мыиспользовали штаммы, производные 1B-D1606, которые несут мутации sup45 нахромосоме, и вносили в них дополнительные копии тех же мутантных аллелей нацентромерных или мультикопийных плазмидах. Оказалось, что сверхэкспрессиямутантных генов sup45-101, -105 и -107 также приводила к компенсациисинтетической летальности, в то время как введение дополнительных копиймутантных аллелей на центромерных плазмидах почти не влияло на рост диплоидов(Рис. 24В).
Однако во всех случаях, гибриды со сверхэкспрессией SFP1 росли хужеконтрольных вариантов, из чего можно сделать вывод, что сверхэкспрессия какмутантных аллелей, так и аллелей дикого типа SUP45 не компенсирует усилениесинтетической летальности, вызванное сверхэкспрессией SFP1.Мы проверили, достаточна ли сверхэкспрессия SUP45 для компенсациитоксичности [PSI+], вызванной сверхэкспрессией SUP35. Выяснилось, что введениемультикопийной плазмиды, несущей SUP45, компенсирует прионную токсичность,вызванную не только сверхпродукцией полноразмерного Sup35, но и егоNM-доменов (Рис. 24Г), чего не наблюдалось ранее (Derkatch et al., 1998;Vishveshwaraetal.2009).Этонаблюдение83позволяетпредположить,чтоиспользованная нами сверхэкспрессия SUP45 давала даже больший уровень белкаSup45, чем в других работах.АВБГРисунок 24.
Коэкспрессия SUP35C, но не SUP45 компенсирует токсичность [PSI+] присверхэкспрессии SFP1. А. Серия 10-кратных разведений OT56 ([PSI+]S) и 2-OT56 ([psi–]), несущихpRS426-SFP1(↑↑SFP1) вместе с pRS315-SUP45 (↑SUP45), pRS425-SUP45 (↑↑SUP45) илиpYX242-SUP35C (↑↑SUP35C); векторы – pRS426 и pRS425. Б. Трансформантов OT56 из (A)растили до логагифмической фазы роста, выделяли белковые лизаты и анализировали с помощьювестерн-блот гибридизации. (+) обозначает продукцию соответствующего белка с низкокопийной, а(++) – с высококопийной плазмиды; (–) – вектор.
В. Производные штамма 1B-D1606, несущиеуказанные аллели sup45, трансформировали pRS425 (вектор) и либо мультикопийными, либоцентромерными плазмидами, несущими те же аллели SUP45, т.е. 1B-D1606 (WT)трансформировали pRS425-SUP45 (↑↑SUP45) или pRS315-SUP45 (↑SUP45), а 101-1B-D1606 (101) –pRS425-sup45-101 (↑↑sup45-101) или pRS315-sup45-101 (↑sup45-101), и т.д. Трансформантовскрещивали с OT56 ([PSI+]S) или 2-OT56 ([psi–]), несущих pRS426-SFP1 (↑↑SFP1) или pRS426(вектор). Г. Серия 10-кратных разведений OT56 ([PSI+]S), несущего pRSU2 (↑SUP35), pRSU4(↑↑SUP35), pmCUP-NM-GFP (pCUP1-SUP35NM-GFP), или pUCNGMC (pCUP1-SUP35N-GFP-MC)вместе с pRS425-SUP45 (↑↑Sup45); векторы – pRS316 и pRS425.
Для индукции промотора CUP1 всреду добавляли 150μM CuSO4.84В поисках механизмов, обуславливающих вызываемую Sfp1 прионнуютоксичность,мыпроверили,какнанеёвлияютнекоторыевзаимодействующие с Sup35 в мономерной или прионной форме.белки,СверхэкспрессияUPF1 (NAM7), гена компонента системы NMD, не влияла на прионную токсичностьприсверхэкспрессииSFP1(Рис.25А).Мыпроверилигеныглавныхцитоплазматических шаперонов, участвующих в поддержании [PSI+], а именно,Hsp104, Hsp70-Ssa1 и Ssa2, и Hsp40-Ydj1 и Sis1. Мы выяснили, что сверхэкспрессияHSP104 и SIS1 полностью компенсировала летальность (Рис.
25Б). Посколькуизвестно, что сверхэкспрессия HSP104 может приводить к изгнанию [PSI+], мыпроверилисупрессиюade1-14,идействительно,клоны,вкоторыхбылсверхэкспрессирован HSP104, потеряли способность расти на среде без аденина (Рис.25Б), то есть приобрели фенотип [psi–], чем и объясняется компенсация токсичностиАБРисунок 25. Сверхэкспрессия SIS1 компенсирует прион-зависимую токсичность присверхэкспрессии SFP1, не изгоняя прион [PSI+]. А.
OT56 трансформирован указаннымиплазмидами. Б. Сверхэкспрессия генов шаперонов HSP104, SSA1, SSA2, SIS1 и YDJ1 вместе с SFP1в OT56. Все гены внесены в штамм на мультикопийных плазмидах под контролем собственныхэндогенных промоторов. А, Б. Контрольные векторы – pRS425 и pRS426. Приведенырепрезентативные серии 10-кратных разведений.85SFP1. Однако сверхэкспрессия SIS1 не изгоняла [PSI+] и не ослабляла его фенотип.Поскольку влияние SIS1 на токсичность [PSI+] ранее не было показано, мы решиливыяснить, повлияет ли SIS1 на прионную летальность [PSI+], вызванную не SFP1 адополнительным Sup35.
Оказалось,что токсичность[PSI+]компенсируетсякоэкспрессией SIS1, не только в случае её возникновения при сверхэкспрессии SFP1(Рис. 25Б), но и в случае прямого увеличения экспрессии SUP35 путём внедрениядополнительных копий гена SUP35 (Рис. 26). Стоит отметить, что толькосверхэкспрессия интактной аллели SIS1, но не вариантов, маркированных генамифлуоресцентных белков на 3’-конце (SIS1-EGFP и SIS1-mCherry) была способнакомпенсировать прионную токсичность [PSI+] (Рис. 26), что говорит о том, что длявыполнения этой функции необходим интактный С-конец белка Sis1.Рисунок 26. Сверхэкспрессия SIS1 компенсирует прионную токсичность [PSI+], вызваннуюдополнительной экспрессией SUP35.
OT56 ([PSI+]S) был трансформирован pRSU2 (↑SUP35),pRSU4(↑↑SUP35),pmCUP-NM-GFP(pCUP1-SUP35NM-GFP),илиpUCNGMC(pCUP1-SUP35N-GFP-MC) вместе с YEp351-SIS1 (↑↑SIS1), pAG415ADH1-Sis1-EGFP (↑SIS1-EGFP)или pAG415GPD-Sis1-mCherry (↑SIS1-mCherry); векторы – pRS316 и YEp351. Для индукциипромотора CUP1 в среду добавляли 150μM CuSO4. Приведены репрезентативные серии 10-кратныхразведений.3.4.7. Sfp1 формирует SDS-устойчивые агрегаты in vivo, которые могутвлиять на [PSI+]Sfp1 потенциально является амилоидогенным белком и содержит Q/N-богатыеучастки, в связи с чем возникает вопрос, способен ли Sfp1 агрегировать в клетках иможет ли его агрегация влиять на свойства [PSI+]. Нами были сконструированывекторы для экспрессии SFP1, слитого с генами флуоресцентных белков.Сверхэкспрессия SFP1-Cerulean под контролем сильного конститутивного промотора86GPD (pTDH3) сильно снижала скорость роста и [PSI+], и [psi–] колоний как натвёрдой, так и в жидкой среде, но не приводила к появлению флуоресцентныхфокусов в подавляющем большинстве клеток (Рис.
27А). Однако в ~5% клетокнаблюдался один или несколько фокусов на фоне диффузного свечения Sfp1-Cerulean,сконцентрированного в области предположительно соответствующей ядру (Рис. 27А).Тем не менее, сверхэкспрессия той же самой химерной конструкции SFP1-CeruleanподконтролеминдуцибельногопромотораCUP1привелакпоявлениюмножественных флуоресцентных фокусов в ~90% клеток (Рис. 27Б). СверхпродукцияSfp1-Cerulean в штаммах [PSI+][PIN+] и [psi–][pin–] не отличалась по характеруфлуоресценции (Рис.
27Б). Таким образом, Sfp1-Cerulean способен формироватьскопления в клетках, которые, в силу возможных амилоидных свойств Sfp1, могутпредставлять собой амилоидные агрегаты.АБРисунок 27. Sfp1-Cerulean при сверхпродукции формирует флуоресцентные фокусы in vivo.Флуоресцентная микроскопия клеток OT56 ([PSI+]S[PIN+]) или 2-OT56 ([psi-][pin-]),трансформированных pRS415GPD-SFP1-Cerulean (А), pR15CUP-SFP1-Cerulean (Б) илиpRS415GPD-Cerulean (А, Б). Представлены репрезентативные изображения с канала CFP и CFP,совмещённого с проходящим светом (CFP+BF).
Б. Клетки визуализировали после 6 часов роста всреде с добавлением 50 μM CuSO4.Однако формирование флуоресцентных фокусов может говорить не только обагрегации белка, но и об изменении характера его локализации в клетке, какнапример, в случае его перераспределения между множеством маленьких87компартментов. Чтобы определить природу формирующихся скоплений Sfp1, мысначала проанализировали содержание белка Sfp1 при различных вариантах егоэкспрессии. Оказалось, что сверхэкспрессия SFP1-Cerulean или SFP1-GFP подконтролем промотора CUP1 приводит к появлению значительного количествасоответствующих белков, в то время как сверхэкспрессия аналогичных аллелей подконтролем промоторов GPD или GAL1 не позволила детектировать соответствующиебелки с помощью вестерн-блот гибридизации (данные не представлены), что говорито невозможности анализировать свойства агрегатов Sfp1 при использованииконструкций с этими промоторами.
Далее мы анализировали свойства агрегатов Sfp1,формирующихся при экспрессии гена под контролем промотора CUP1. Мы провелиSDD-AGE, в котором пробы белковых лизатов преинкубировали либо при комнатнойРисунок 28. Сверхпродуцированный Sfp1-Cerulean формирует SDS-устойчивые агрегаты иувеличивает размер агрегатов [PSI+]. SDD-AGE проводили с белковыми лизатами, выделеннымииз трансормантов OT56 ([PSI+]) или 2-OT56 ([psi-]) плазмидами pRS426 (вектор), pRS426-SFP1(↑↑SFP1) или pR16CUP-SFP1-Cerulean (↑SFP1-Cerulean), а также YEp351-SIS1 длясверхэкспрессии SIS1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
