Диссертация (1145681), страница 19
Текст из файла (страница 19)
На обилие Cur1 в клетке влияет уровень Sis1 и присутствие [PSI+], но не влияетинактивация ядерного экспорта. А – Г. Результаты вестерн-блот гибридизации белков,выделенных из 2-OT56 ([psi–]) или OT56 ([PSI+]S), трансформированных конструкциями дляэкспрессии указанных вариантов SIS1 и CUR1. Б. Клетки растили до достижения логарифмической(лог.; OD600=0,7) или стационарной (стац.; OD600=1,2) фазы роста. # – продукт деградацииSis1-mCherry; * – полоса неспецифичного связывания антител против флуресцентных белков;тотальный белок – окраска мембраны Coumassie R250. Г. Клетки лизировали после инкубации при39 °C в течение указанного количества минут.
Д. Сравнение последовательностей известных NESбелков S. cerevisiae с последовательностью 6-22 а-к Cur1. Синими рамками обведены гидрофобныеостатки со схожим относительным расположением. Е. Флуоресцентная микроскопиятрансформантов штамма MNY8 плазмидами для экспрессии указанных вариантов CUR1. Клеткианализировали после 60 минут роста в присутствии лептомицина Б.
Ж. Результаты вестерн-блотгибридизации проб белков клеток из (Е) с антителами против флуоресцентных белков.111Мы также обратили внимание на то, что количество детектируемого Cur1 заметноснижено в стационарной фазе роста культуры, по сравнению с логарифмической(Рис. 43Б). Присутствие приона [PSI+] также приводило к снижению уровнядетектируемого Cur1 в клетках (Рис.
43B).Как и у многих генов шаперонов, экспрессия SIS1 повышается при тепловомшоке (Luke et al., 1991). Количество Cur1 также возрастает в условияхтемпературного стресса (Malinovska et al., 2012). Мы решили проверить, не связаныли эти явления между собой. Для этого мы проследили динамику изменений вколичестве Sis1 и Cur1 в ходе теплового шока. Как и ожидалось, уровни обоихбелков повышались в ответ на увеличение температуры, однако уровень Sis1возрастал заметно медленнее, чем уровень Cur1 (Рис.
43Г), что говорит о том, чтоболее высокий уровень Cur1 при тепловом шоке, вероятно, не обусловлен толькоусилением экспрессии SIS1. Известно, что Cur1 является нестабильным белком, таккакбыстроразрушаетсячерезубиквитин-протеасомныйпутьдеградации(Malinovska et al., 2012). Можно предположить, что Sis1 может стабилизировать Cur1,препятствуя его деградации. Но данная гипотеза не объясняет, почему уровеньCur1Δ3-22 в клетке выше, чем у полноразмерного белка.Мы обратили внимание, что в составе района 3-22 а-к присутствуетпоследовательность, которая сходна с сигналом Crm1-зависимого ядерного экспорта(NES), описанного у некоторых белков дрожжей (см.
la Cour et al., 2003) (Рис. 43Д).Чтобы проверить, связана ли стабильность Cur1Δ3-22 с возможным дефектомядерного экспорта, мы сравнили эффекты экспрессии CUR1 и cur1Δ3-22 в штаммеMNY8, несущем мутацию в гене экспортина Crm1, благодаря которой этот белокприобретаетспособностьинактивироватьсяврезультатевзаимодействияслептомицином Б (Neville & Rosbash, 1999). Мы не обнаружили различий влокализации как полноразмерного Cur1, так и варианта Δ3-22 у штаммов сблокированным лептомицином Б ядерным экспортом (Рис.
43E). Анализ уровнейбелков показал, что блокировка ядерного экспорта не приводит к увеличению112количества Cur1, в отличие от делеции участка 3-22 а-к (Рис. 43Ж). Таким образом,бóльшая стабильность Cur1Δ3-22 по-видимому не связана с нарушением ядерногоэкспорта из-за делеции N-концевой последовательности Cur1.СвязанылиболеесильныеэффектыCur1Δ3-22посравнениюсполноразмерным вариантом с бóльшим количеством продуцируемого белка? Чтобыответить на этот вопрос сначала мы проанализировали эффекты сверхэкспрессииCUR1 на локализацию Sis1 при тепловом шоке и на фоне ингибирования клеточныхпротеасом, так как известно, что в обоих случаях уровень Cur1 возрастает(Malinovska et al., 2012). Выяснилось, что после 1 часа инкубации при 37 °C ядерныйимпортSis1действительностановилсяболееинтенсивным(Рис.45А).Ингибирование протеасом с помощью реагента MG132 приводило похожимэффектам, но кроме того приводило к появлению фокусов Cur1 которые не быликолокализованы с Sis1.
В большей степени этот эффект проявлялся при действииMG132 в 37 °C (Рис. 45А). Эти наблюдения согласуются с данными лаборатории С.Альберти о локализации Cur1 и Sis1 в условиях ингибирования протеасом притепловом шоке (Malinovska et al., 2012). При этом, ингибирование протеасом невлияло на характер релокализации Sis1 при сверхэкспрессии cur1Δ3-22 (Рис. 45Б).Оценка эффективности ядерного импорта Sis1 показала, что при сверхэкспрессииCUR1 доля клеток с преимущественно ядерной локализацией Sis1 возрастает до~50% при росте в присутствии MG132 (Рис.
45В). Такой же процент клетокнаблюдался при сверхэкспрессии cur1Δ3-22, причём добавление MG132 не влияло наэффективность ядерного импорта при сверхпродукции этого варианта Cur1 (Рис.45В). Мы также подтвердили, что в присутствии MG132 уровень полноразмерногоCur1 возрастал, в то время как присутствие этого ингибитора протеасом не влияло науровень Cur1Δ3-22 (Рис.
45Г). Таким образом, более сильное влияние Cur1Δ3-22 наприоны [PSI+] и [URE3] по-видимому связано с нарушением деградации у этогобелка, а последовательность, отсутствующая у этого варианта, в норме способствуетбыстрой деградации полноразмерного Cur1 через убиквитин-протеасомную систему.113АБВГРисунок 45. Количество Cur1 зависит от протеасомной деградации, нарушенной у вариантаCur1Δ3-22. А, Б. Трансформантов OT56 ([PSI+]S) указанными конструкциями растили вприсутствии 40 мкM MG132 или DMSO (контроль) в течение 1 часа при 26, 37 oC (А) или 30 oC (Б)и анализировали с помощью широкопольной флуоресцентной (А) или конфокальной (Б)микроскопии.
Стрелки указывают на фокусы Cur1-mCherry, не колокализующиеся с Sis1. В. Оценкасреднего числа клеток из (Б) с преимущественно ядерной локализацией Sis1 из пяти полей зрения.Планки погрешностей обозначают доверительные интервалы, рассчитанные по t-критериюСтьюдента (уровень значимости 0,05). Г. 2-OT56 ([psi–]) трансформировали конструкциями из (Б) иpAG416GPD-Cur1-EGFP (pGPD-CUR1-EGFP), аналогично обрабатывали MG132, после чеговыделяли из клеток белки и анализировали их с помощью вестерн-блот гибридизации.1144.
Обсуждение результатов4.1.Кодон-специфичноеснижениесинтетическойлетальностиприсверхэкспрессии гена тРНКTrpКонструкцияYep13-184-2(Рис.1)единственнаявданнойработепродемонстрировала ослабление синтетической летальности, но не настолькосильное как, например, при экспрессии SUP35C. Кроме того, гибриды ОТ56 [PSI+]Sсо штаммом 1A-D1628, несущим мутацию sup45-107 показывают лучший рост, чем ваналогичном скрещивании с мутацией sup45-105. Подобная избирательность визменении нонсенс-супрессорных свойств может говорить о роли гена тРНК.Действительно, оказалось, что данный фрагмент содержит тРНКTrp tW-G1,содержащуюантикодонССАиименноеёизбытоквызываетснижениесинтетической летальности и супрессию ade1-14 (UGA), но не trp1-289 (UAG).sup45-105 и sup45-107 – различные по своей природе нонсенс-мутации: в случаеsup45-105 – кодон соответствующий Glu385 заменён на стоп-кодон UAA, а в случаеsup45-107 – Leu317 заменён на стоп-кодон UGA (Moskalenko et al., 2003).
Такимобразом, различный уровень супрессии этих двух мутаций можно объяснить спозиции «wobble»-взаимодействия, а именно тем, что два первых основаниянонсенса UGA комплементарны двум основаниям антикодона ССA, а в UAA толькооснование в 1-м положении, комплементарно соответствующему основаниюантикодона. тРНКTrp не является естественной супрессорной для стоп-кодона UAA,но является таковой для UGA, поэтому при избытке данной тРНКTrp, она с большейвероятностью сможет связаться не с sup45-105 с sup45-107 в тот момент, когдарибосома подойдёт к соответствующему нонсенс-триплету на мРНК SUP45(Матвеенко и др., 2013). Сходное кодон-специфичное снижение синтетическойлетальности наблюдалось ранее при исследовании влияния супрессорной тРНКSUQ5 в используемой нами тест системе (Kiktev et al., 2007).
В этом случаемутантная тРНКSer SUQ5, прочитывающая стоп-кодон UAA, была способнавосстанавливать жизнеспособность штаммов, несущих фактор [PSI+] в комбинации с115нонсенс-мутацией sup45-105 (UAA), но не с sup45-107 (UGA).4.2. Влияние факторов элонгации трансляции на нонсенс-супрессию исинтетическую летальностьРанее в лаборатории М.Д. Тер-Аванесяна были получены данные о том, чтосверхэкспрессия гена TEF2 повышает вероятность прочитывания стоп кодонов какзначащих, а сверхэкспрессия TEF3 (CAM1), TEF4 или TEF5 (EFB1) – снижает.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
