Диссертация (1145681), страница 22
Текст из файла (страница 22)
Мы наблюдали126усиление синтетической летальности и фенотипа [PSI+] только при сверхэкспрессииSSA1, однако ни один из белков Ssa не усиливал потерю приона [URE3]. Этонесоответствие опубликованным данным об изгнании [URE3] при избытке Ssa1(Schwimmer & Masison, 2002) скорее всего объясняется тем, что описанный эффектне универсален, а проявляется только для некоторых штаммов приона [URE3] (Ю.О.Чернов, личное сообщение).Мы обнаружили, что влияние других шаперонов на [PSI+] и [URE3], а именноHsp40-Ydj1 и Hsp42, также антагонистично.
Но влияние Cur1 на прионыпо-видимому не зависин от Hsp42 и Ydj1, хотя нам не удалось протестировать всекомбинации, главным образом из-за сильного снижения скорости роста при делецииYDJ1 (данные не представлены), которое затрудняет анализ.Показано, что эффекты Cur1 и Btn2 на прионы [URE3] и [NRP1C+]компенсируются Sis1, жизненно-важным шапероном Hsp40 (Malinovska et al., 2012,Wickner et al., 2014).
Мы показали, что усиление фенотипа [PSI+] и изгнание [URE3]при сверхэкспрессии CUR1 также компенсируется увеличением уровня Sis1 в клетке,причём эффективность излечивания [URE3] тем ниже, чем больше уровеньпродукции Sis1. Таким образом, проявление Cur1 во многом зависит от баллансаCur1 и Sis1 в клетке.В целом мы приводим ряд доводов в пользу того, что Cur1 влияет на прионыопосредованно, через сортинг Sis1, и напрямую не вовлечён в транспорт прионныхагрегатов.
Во-первых, эффективность изгнания [URE3] при избытке Cur1 обратнозависит от уровня Sis1 в клетке. Во-вторых, дополнительная экспрессия SIS1приводит в целом к ухудшению Cur1-зависимого ядерного импорта Sis1. В третьих,мы не наблюдали связывание Cur1 с агрегатами [PSI+] в «pull-down»-экспериментах,то, что нам не удалось детектировать взаимодействие строго говоря не доказываетего отсутствие. Мы предлагаем модель влияния Cur1 на прионы (Рис.
46), котораяобъясняет различное проявление сверхэспрессии CUR1 в штаммах [PSI+] и [URE3],127различной потребностью этих шаперонов в наличии цитоплазматического Sis1. В товремя как [URE3] неспособен стабильно поддерживаться при переходе большейчасти Sis1 в ядро, [PSI+] менее чувствителен к этому, и даже усиливает своёфенотипическое проявление, хотя точные молекулярные механизмы этого пока неясны и должны стать предметом дальнейшего изучения.Рисунок 46. Предполагаемая схема влияния Cur1 на прионы [PSI+] и [URE3].4.6.
ЗаключениеВ результате скрининга сверэкспрессионной библиотеки генов, нам удалосьустановить влияние ещё 10-ти плазмид на синтетическую летальность [PSI+] смутациями sup45. Одна из плазмид снижает синтетическую летальность, что связанос присутствием гена триптофановой тРНК (tW(CCA)G1) в её последовательности,которая выступает в роли мультикопийного супрессора. Нам удалось установитьгены, ответственные за наблюдаемое усиление синтетической летальности, вчетырех из оставшихся девяти плазмид. Это HLJ1 (присутствует на двух плазмидах),128MCM1 и TEF2. Анализ оставшихся пяти плазмид может также позволить выявитьновые факторы, влияющие на терминацию трансляции или на прионы.При изучении влияния MCM1 мы обнаружили, что другой глобальныйрегулятортранскрипции,SFP1,действуетсхожимобразом.По-видимому,сверхэкспрессия обоих генов приводит к увеличению экспрессии SUP35, что можетприводить к усилению приона [PSI+].
Мы предполагаем, что влияние MCM1 и SFP1на синтетическую летальность является одним из проявлений их функций врегуляции транскрипции гена SUP35 и, возможно, SUP45. Неясной остаётся причина,по которой конститутивная сверхэкспрессия МСМ1 не приводит к тем же эффектам,что и его индуцируемая экспрессия. Возможно, клетки успевают адаптироваться квысокому уровню этого фактора благодаря механизмам обратной связи. Несмотря наобогащённость остатками глутамина, ни один из тестов в работе С. Альберти ссоавторами не указал на прионные свойства белка Mcm1, но Sfp1 содержитпотенциально прионогенный домен (Alberti et al., 2009). Мы также показали, чтоSfp1 может формировать детергент-устойчивые агрегаты а значит нельзя исключать,что эффекты сверхэкспрессии Sfp1 обусловлены его прионными свойствами иливзаимодействием с агрегатами [PSI+].В отношении шаперонов и факторов их сортинга, мы предполагаем, чтонаблюдаемые разнообразные эффекты связаны именно с влиянием на прионы.
Мыпоказали, что сверхэкспрессия CUR1, HSP42 и YDJ1 независимо друг от другаприводит к усилению приона [PSI+] (и, как следствие, к усилению синтетическойлетальности). Вероятно и вызваемая ими потеря приона [URE3] не требует участия вэтом процессе всех трёх соответствующих белков. Тот факт, что эти три генаучаствуют в работе клеточных PQC, говорит о том, что направленный транспортшаперонов является важным процессом для стабильного поддержания прионов удрожжей.
Мы получили доказательства того, что влияние Сur1 на прионы [PSI+] и[URE3], несмотря на то, что оно разнонаправленное, связано с механизмомCur1-зависимого ядерного импорта Sis1. Интересно отметить, что мы наблюдали129локализацию Cur1 в перинуклеарных компартментах, которые могут являтьсяэлементами PQC, только в условиях нарушенной работы протеасом или припродукции дефектного и нефункционального Cur1, что говорит о том, что, возможно,описанный вклад Cur1 в транспорт шаперонов между компартментами PQC былпереоценен. Но для того чтобы однозначно определить взаимосвязь Cur1 cсистемами PQC требуется дальнейшее изучение этого вопроса.1305.
Выводы1. Установлено влияние белков, кодируемых генами TEF2, MCM1, и HLJ1, насинтетическую летальность приона [PSI+] с мутациями sup45.2. Естественные супрессорные тРНК могут кодон-специфично влиять насинтетическую летальность, что продемонстрировано на примере тРНКTrp.3. Ген TEF2, кодирующий фактор элонгации трансляции eEF1A, являетсямультикопийным аллосупрессором как фактора [PSI+], так и мутаций sup45.4. Транскрипционная регуляция генов, кодирующих факторы терминациитрансляции, может влиять на эффективность нонсенс-супрессии в присутствии[PSI+], что показано на примере влияния белков Sfp1 и Mcm1.5.
Одним из эффектов, приводящих к повышению синтетической летальности,является усиление токсичности приона [PSI+], которое может возникать вследствиеувеличения транскрипции гена SUP35.6. Шаперон Hsp40-Sis1 ослабляет прионную токсичность [PSI+].7. Влияние гена CUR1 на свойства прионов [PSI+] и [URE3] связано свлиянием кодируемого им белка на ядерный импорт шаперона Sis1.8. N-концевойрайонбелкаCur1убиквитин-протеасомному механизму.131важендляегодеградациипоСписок литературы1.Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A.
& Lindquist, S. A systematic survey identifies prionsand illuminates sequence features of prionogenic proteins. Cell 137, 146–158 (2009).2.Alksne, L. E., Anthony, R. A., Liebman, S. W. & Warner, J. R. An accuracy center in the ribosomeconserved over 2 billion years. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 9538–9541 (1993).3.Allen, K. D.
et al. Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssbon the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+]. Genetics 169, 1227–1242 (2005).4.All-Robyn, J. A., Brown, N., Otaka, E. & Liebman, S. W. Sequence and functional similaritybetween a yeast ribosomal protein and the Escherichia coli S5 ram protein. Mol. Cell. Biol. 10, 6544–6553(1990).5.Amrani, N.
et al. A faux 3’-UTR promotes aberrant termination and triggers nonsense-mediatedmRNA decay. Nature 432, 112–118 (2004).6.Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G. & Kinzy, T. G. Functionalinteractions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3. J. Biol. Chem. 278,6985–6991 (2003).7.Andersen, G. R. et al. Structural basis for nucleotide exchange and competition with tRNA in theyeast elongation factor complex eEF1A:eEF1Balpha. Mol. Cell 6, 1261–1266 (2000).8.Anthony, R.
A. & Liebman, S. W. Alterations in ribosomal protein RPS28 can diversely affecttranslational accuracy in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 140, 1247–1258 (1995).9.Araki, Y. et al. Ski7p G protein interacts with the exosome and the Ski complex for 3’-to-5’ mRNAdecay in yeast. EMBO J. 20, 4684–4693 (2001).10.Atkinson, G. C., Baldauf, S. L. & Hauryliuk, V. Evolution of nonstop, no-go andnonsense-mediated mRNA decay and their termination factor-derived components. BMC Evol. Biol.
8,290 (2008).11.Bagriantsev, S. N., Gracheva, E. O., Richmond, J. E. & Liebman, S. W. Variant-specific [PSI+]infection is transmitted by Sup35 polymers within [PSI+] aggregates with heterogeneous proteincomposition. Mol. Biol. Cell 19, 2433–2443 (2008).12.Bailleul, P. A., Newnam, G. P., Steenbergen, J. N. & Chernoff, Y. O. Genetic study of interactionsbetween the cytoskeletal assembly protein sla1 and prion-forming domain of the release factor Sup35(eRF3) in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 153, 81–94 (1999).13.Barthelme, D.
et al. Ribosome recycling depends on a mechanistic link between the FeS clusterdomain and a conformational switch of the twin-ATPase ABCE1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108,1323228–3233 (2011).14.Barthelme, D. et al. Structural organization of essential iron-sulfur clusters in the evolutionarilyhighly conserved ATP-binding cassette protein ABCE1. J. Biol. Chem. 282, 14598–14607 (2007).15.Baxa, U., Cassese, T., Kajava, A. V. & Steven, A. C.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
