Диссертация (1145681), страница 18
Текст из файла (страница 18)
39А). Кроме того, мыподтвердили, что сверхэкспрессия SIS1 препятствует изгнанию [URE3], вызванномусверхэкспрессией BTN2 (Рис. 39Б). С помощью различных конструкций для103АГБВДРисунок 39. Влияние CUR1 на прионы компенсируется коэкспрессией SIS1. A-В. ШтаммыOT56 и OT520 были трансформированы плазмидами для сверхэкспрессии вариантов CUR1 илиBTN2 и плазмидами, обеспечивающими разный уровень экспрессии Sis1 в указанных комбинациях.Трансформантов анализировали с помощью серий 5-кратных разведений на селективных средах.
Г.Вестерн-блот (сверху) и результаты денситометрии (снизу) для трёх независимых измеренийколичества Sis1 относительно тотального белка. Нативный уровень Sis1 принят за 1; планкипогрешностей выражают стандартное отклонение. Плазмиды (слева направо): pRS315,pRS315-Sis1,pAG415ADH1-Sis1-EGFP,pAG415GPD-Sis1-mCherry,YEp351-Sis1.Д.Количественная оценка частоты потери приона [URE3] при сверхэкспрессии CUR1 или cur1Δ3-22на фоне различных уровней коэкспрессии SIS1 (чёрные столбцы, соответствуют результатамденситометрии из Г.). EG – EGFP; mC – mCherry.
Планки погрешностей обозначают доверительныеинтервалы (уровень значимости 0,05). *, p<0,05; ***,p<0,001.104экспрессии SIS1 мы также показали, что для компенсации более сильных эффектоваллели cur1Δ3-22, необходимы более высокие уровни экспрессии Sis1 (Рис. 39Б).Количество продуцируемого Sis1 при наличии разных векторов для его экспрессиибыло оценено в штамме OT56 с помощью вестерн-блот гибридизации (Рис. 39Г).Количественный анализ частоты потери [URE3] подтвердил, что стабильностьприона на фоне сверхэкспрессии CUR1 выше, чем при сверхэкспрессии cur1Δ3-22, иона прямо зависит от уровня продукции Sis1 в клетке (Рис. 39Д).
Таким образом, Sis1дозозависимо компенсирует эффекты сверхэкспрессии CUR1. Мы также установили,что изгнание [URE3] при сверхэкспрессии BTN2 не так эффективно компенсируетсяSIS1, так как даже при максимальном уровне Sis1 прион продолжает теряться, хотя исо значительно меньшей частотой (Рис. 39Д).Стоит отметить, что экспрессия различных конструкций с SIS1 не приводилани к ослаблению [PSI+]S (Рис.
39А,В), ни к дестабилизации [PSI+]W (Рис. 40А), чтоговорит о том, что снижение супрессорного эффекта CUR1 при коэкспрессии SIS1 неявляется следствием суперпозиции двух разнонаправленных эффектов. Более того,мы заметили, что наличие генов флуоресцентных белков на 3’-конце SIS1 можетАБВРисунок 40.
Присутствие флуоресцентного белка на С-конце Sis1 влияет на фенотип [PSI+].А. Количественная оценка частоты потери [PSI+]W при различных уровнях экспрессии SIS1. OT55трансформирован плазмидами для экспрессии Sis1 (см. подпись к Рис. 39), а такжеpAG415GPD-Sis1-HA (SIS1-HA). Планки погрешностей обозначают доверительные интервалы(уровень значимости 0,05). Б.
Серия пятикратных разведений OT56, трансформированногоплазмидами для экспрессии Sis1. В. Посевы с десятикратными разведениями штаммов GT81-1C(SIS1) и GT1903-3B (SIS1-GFP) на селективные среды для оценки нонсенс-супрессии.105приводить к усилению супрессии [PSI+], чего не наблюдается при экспрессииинтактных аллелей SIS1 (Рис.
40Б). Наличие в штамме химерной конструкцииSIS1-GFP, в качестве единственного источника Sis1 также приводит к небольшомуусилению супрессорного фенотипа [PSI+] (Рис. 40В). В совокупности с данными онеспособности химерных вариантов SIS1 ослаблять прионную токсичность [PSI+](см. разделы 3.4.6 и 3.4.7) можно сделать вывод о том, что наличие маркера наС-конце Sis1 может влиять на его взаимодействие с прионом [PSI+].3.5.7. Избыток Cur1 усиливает ядерный импорт Sis1, а избыток Sis1 егоснижаетИзвестно, что Сur1 способствует транспорту Sis1 в ядро, что объясняет егоспособность изгонять прион [NRP1C+] (Malinovska et al., 2012). Мы решилипроверить влияние Cur1 на внутриклеточную локализацию Sis1 в штаммах [PSI+] и[URE3], и показали, что Cur1 и Sis1 колокализуются в большинстве клеток, причёмсверхэкспрессия нормальной аллели CUR1 приводит к тому, что Sis1 релокализуетсяв ядро примерно в ~15-20% клеток, в то время как сверхэкспрессия cur1Δ3-22повышает долю клеток с локализованным в ядре Sis1 до ~50% (Рис.
41А, Б).Количественные и качественные эффекты сверхэкспрессии CUR1 и cur1Δ3-22 былиодинаковы в штаммах OT56 ([PSI+]S) и OT520 ([URE3-1]) (Рис. 41А, Б). Мы такжепроверили, как отсутствие хромосомной копии CUR1 повлияет на релокализациюSis1, но не обнаружили ни качественных, ни количественных различий вэффективности ядерного импорта Sis1 при сверхэкспрессии как полноразмерногоCUR1-EYFP, так и cur1Δ3-22-EYFP (Рис. 41). Мы дополнительно изучили эффектыаллели сur1Δ162-204, которая не влияла на фенотипические свойства [PSI+] и [URE3].При сверхэкспрессии сur1Δ162-204-EYFP мы почти не наблюдали Sis1 в ядре, но вредких случаях появлялись перинуклеарные фокусы, в которых Sis1-mCherryколокализовался с Cur1Δ162-204-EYFP (Рис.
41В). Вероятно, данная делецияприводит к неспособности комплекса Cur1/Sis1 транспортироваться внутрь ядра.106АБВРисунок 41. Избыток Cur1 способствует релокализации Sis1 в ядро в штаммах [URE3] и[PSI+]. Трансформантов штаммов OT520 (А), OT56 (Б) и OT56-ck (В) плазмидойpAG415GPD-Sis1-mCherry вместе с плазмидами для экспрессии указанных вариантов CUR1,слитых с EYFP, анализировали с помощью конфокальной микроскопии. Слева показанырепрезентативные поля зрения; справа – оценка среднего числа клеток с ядерно-локализованнымSis1 из четырёх полей зрения.
Планки погрешностей обозначают доверительные интервалы,рассчитанные по t-критерию Стьюдента (уровень значимости 0,05). Стрелки указывают наперинуклеарные фокусы Cur1Δ162-204-EYFP.107Мы предположили, что транспорт Sis1 в ядро приводит к его невозможностисвязываться с прионными агрегатами, и, таким образом, чем больше Sis1 оказываетсяв ядре, тем больше усиливается супрессия в [PSI+] и тем менее стабильнымоказывается прион [URE3]. Но эксперименты по изучению локализации Sis1 былипроведены при дополнительной сверхэкспрессии SIS1-mCherry на фоне интактнойхромосомной копии SIS1 в штаммах (Рис.
41). Возникает вопрос, как отсутствиедополнительнопродуцируемогоSis1скажетсянаегоядерномимпорте,опосредованном Cur1. Чтобы ответить на него, мы сравнили частоты релокализацииSis1-GFP в ядро у штамма OT56, c эктопической экспрессией SIS1-EGFP на фоненативной экспрессии SIS1 на хромосоме (Рис.
42А), co штаммом GT1903-3B, гдеАБРисунок 42. Опосредованный Cur1 ядерный импорт Sis1 менее эффективен придополнительной экспрессии SIS1. Конфокальная микроскопия клеток ОТ56 (А) и GT1903-3B (Б),экспрессирующих указанные аллели CUR1 и SIS1. Штаммы трансформировали плазмидамиpRS426-CUR1-mCherryилиpRS426-cur1Δ3-22-mCherry;вектор–pRS426.OT56котрансформировали pAG415ADH1-Sis1-EGFP. Слева показаны репрезентативные поля зрения;справа – оценка среднего числа клеток из четырёх полей зрения с преимущественно ядернойлокализацией Sis1. Планки погрешностей обозначают доверительные интервалы, рассчитанные поt-критерию Стьюдента (уровень значимости 0,05).108единственным источником Sis1 служит хромосомная аллель SIS1-GFP (Рис. 42Б).Доля клеток, в которых наблюдалась релокализация Sis1, оказалась существеннониже при дополнительной продукции Sis1-EGFP на фоне интактной хромосомнойкопии гена, чем при нативном уровне Sis1-GFP (Рис.
42А, Б). Таким образом,повышение уровня Sis1 в клетке снижает эффективность его импорта в ядро, авлияние гена CUR1 на прионы может быть опосредовано снижением содержанияSis1 в цитозоли.3.5.8. Сверхэкспрессия Cur1 не влияет на связывание шаперонов сагрегатами [PSI+]При сверхэкспрессии CUR1 происходит релокализация Sis1 в ядро, что должнопрепятствовать его связыванию с агрегатами [PSI+]. Мы проверили эту гипотезу спомощью метода «pull-down», который позволяет оценить связывание белков сприонными агрегатами Sup35 (Kiktev et al., 2015). Для этого мы продуцировалиSup35NM, маркированный His6, что позволяет изолировать этот белок из дрожжей спомощью афинной хроматографии. Поскольку Sup35NM коагрегирует с амилоидамиSup35 в штамме [PSI+], вместе с Sup35NM-His6 можно осадить и агрегаты нативногоSup35, а вместе с ними – связанные с ними белки (Рис. 43А).
МысверхэкспрессировалиCUR1смультикопийнойплазмидыподконтролемсобственного промотора, или с центромерной плазмиды под контролем промотораGPD. В обоих случаях нам не удалось детектировать изменение уровней Sis1 и Ydj1,осаждённых на хроматографической колонке, т.е. связанных с агрегатами Sup35 (Рис.43Б). Поскольку метод «pull-down» не является строго количественным, мы неможем утверждать об отсутствии влияния Cur1 на связывание шаперонов сагрегатами [PSI+], однако подтвердить наличие этого влияния нам также не удалось.Мы также наблюдали отсутствие Cur1 и Cur1Δ3-22 во фракциях, содержащихагрегаты Sup35 (данные не представлены), что может говорить о неспособности этихбелков физически взаимодействовать с агрегатами [PSI+].109АБРисунок 43.
Шапероны, связанные с агрегатами [PSI+] А. Результаты вестерн-блотгибридизации фракций, отобранных при афинной хроматографии белков OT56, осаждающихсявместе с Sup35NM-His6. Отмечены фракции белков, отобранные до нанесения нахроматографическую колонку (input) и после смыва белков, связанных с колонкой (pull-down). Б.Сравнение фракций input и pull-down из лизатов OT56, трансформированного pRS426-CUR1(↑↑CUR1) или pAG416GPD-Cur1-EGFP (pGPD-CUR1-EGFP); контрольный вектор – pRS426.3.5.9. Уровень Cur1 в клетке регулируется по механизму протеасомнойдеградацииАнализ уровней продуцируемых белков при сверхэкспрессии различныхвариантов CUR1 показал, что белок Cur1Δ3-22 присутствовал в клетках взначительно большем количестве, чем белок дикого типа или вариант с делецией вC-проксимальной части белка (Рис.
43А). Это наблюдение объясняет более сильныеэффекты, которые сверхэкспрессия соответствующего гена оказывает на прионы[PSI+] [URE3] (см. раздел 3.5.4). Поскольку ранее мы наблюдали компенсациювлияния CUR1 на прионы при коэкспрессии SIS1, мы проверили, не приводит лиизбыток Sis1 к снижению количества Cur1. Но оказалось, что сверхэкспрессия SIS1не только не снижает, но значительно увеличивает количество детектируемого белкаCur1, причём как полноразмерного, так и содержащего делецию в N-терминальнойчасти (Рис. 43А). При использовании конститутивного промотора GPD вместоэндогенного для сверхэкспрессии CUR1, дополнительная экспрессия SIS1 такжеприводила к увеличению количества Cur1 (Рис. 43А), что позволяет исключитьтранскрипционную регуляцию, как возможную причину повышения уровня Cur1.110АБВГДЕЖРисунок 44.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
