Диссертация (1145681), страница 20
Текст из файла (страница 20)
Этаработа была сделана с применением сложной системы летального взаимодействиямутаций sup45-sl23ts и SUP35C (Valouev et al., 2009). В данной работе мыиспользовали похожую систему, но принципиальными отличиями являются,во-первых, присутствие приона [PSI+] в качестве фактора, создающего дефицитфункциональных молекул Sup35, и, как следствие, Sup45, а во-вторых, показателироста и жизнеспособности оцениваются на гибридах, а это означает, что во всехклетках присутствуют гены дикого типа, кодирующие факторы терминациитрансляции. Мы обнаружили аналогичные проявления генов факторов элонгациитрансляции по их влиянию на нонсенс-супрессию в штамме [PSI+]. СверхэкспрессияTEF2 приводила к усилению синтетической летальности, однако мы не наблюдалисущественногоснижениясинтетическойлетальностиприсверхэкспрессииостальных факторов, при том, что они приводили к явной антисупрессии [PSI+].Ранее утверждалось, что синтетическаяя летальность напрямую зависит от уровнясупрессии у формирующихся диплоидов (Kiktev et al., 2007).
Наши новые данныеговорят о том, что это может не всегда быть так. Объяснением этому факту можетслужить то, что тест-система более чувствительна к изменениям в поддержаниифактора [PSI+], чем в аппарате трансляции. Чтобы подтвердить или опровергнуть этугипотезу необходимо более глубокое изучение этого вопроса, однако возможностьподобного поведения тест-системы, т.е.
получение ложно-отрицательного результатапри действии трансляционных антисупрессоров, необходимо учитывать придальнейшем использовании тест-системы.116До сих пор механизм усиления нонсенс-супрессии при избытке eEF1A точнонеизвеcтен. Влияние eEF1A на точность трансляции можно объяснить его участием вмеханизме кинетической коррекции. В процессе образования кодон-антикодоновойпары происходит гидролиз ГТФ до ГДФ, который приводит к высвобождению eEF1Aизкомплексасаа-тРНКкодон-антикодоновойпарыирибосомой.энергияПригидролизаобразованииГТФможетнеправильнойтратитьсянавысвобождение аа-тРНК из А-сайта рибосомы.
Подтверждение того, что гидролизГТФ необходим для поддержания точности трансляции было получено при анализемутаций, которые влияют на связывание eEF1A с ГТФ и на гидролиз ГТФ. Так,аминокислотныезамены,впределахГТФ-связывающейконсенсуснойпоследовательности NKXD фактора eEF1A, приводят к перекодировкам кодонов всистеме in vitro, а in vivo в 4 раза повышают уровень прочтения всех трехстоп-кодонов как значащих (Carr-Schmid et al., 1999). Тем не менее, остаётсяоткрытым вопрос, почему увеличение общего количества eEF1A в клетке приводит кснижению точности трансляции, а снижение уровня eEF1A, вызванное делециейTEF2, – наоборот, к её повышению.Мы обнаружили, что сверхэкспрессия TEF2 усиливает супрессию не толькофактора [PSI+], но и мутаций sup45, влияя таким образом на оба компонентатест-системы синтетической летальности.
Таким образом избыток eEF1A усиливаетнонсенс-супрессию вне зависимости от того, какое нарушение аппарата терминациитрансляции является её причиной. По крайней мере, не имеет значения, вызвана лисупрессия нарушениями в работе eRF1 или eRF3, и наследуется ли супрессорхромосомноилицитоплазматически.Можнопредположить,чтомеханизмаллосупрессии при избытке eEF1A не связан ни с работой eRF1, ни с eRF3.
Было быинтересно изучить проявление аллосупрессии eEF1A на фоне других типовсупрессоров: мутаций в генах рибосомных белков или супрессорных тРНК, так каквзаимодействия eEF1A и с рибосомой и с тРНК играют ключевую роль в процессеэлонгации трансляции.1174.3. Анализ Q/N-богатых регуляторов транскрипции в тест-системе.Спомощьютест-системысинтетическойлетальностинамибылопротестировано влияние сверхпродукции ряда белковых факторов с известнымифункциями в регуляции транскрипции или процессинге мРНК на нонсенс-супрессиюи жизнеспособность штаммов дрожжей. Одним из ограничений для использованнойтест-системы,котороеудалосьвыявитьвходеданнойработы,являетсяневозможность анализировать гены, значительно снижающие жизнеспособность илискорость роста клеток при сверхэкспрессии. Среди выбранных генов таковымиоказались ABF1, FKH2 и REB1.
Все они кодируют глобальные транскрипционныеактиваторы, необходимые для нормального функционирования множества клеточныхпроцессов (Hughes & de Boer, 2013). В частности, ABF1 и REB1 участвуют врегуляции транскрипции SUP35 и SUP45 (Dagkesamanskaya & Ter-Avanesyan, 1991).Ранее было показано, что сверхэкспрессия ABF1, FKH2 и REB1 может угнетатьрост (Нижников и др., 2013; Sopko et al., 2006; Yoshikawa et al., 2011), но прионныйстатус штаммов, использованных в этих работах, неизвестен. В нашей работевпервые показано, что в штаммах [PSI+] рост подавлен в гораздо большей степени,чем в штаммах [psi-].
В ходе экспериментов мы также обнаружили, что степеньугнетения роста при сверхэкспрессии ABF1, FKH2 и REB1 связана с силой приона.Этот факт позволяет предположить, что эти гены могут оказывать влияние натоксичность [PSI+]. Поскольку Abf1 и Reb1 имеют сайты связывания в промотореSUP35 (Dagkesamanskaya & Ter-Avanesyan, 1991, а наличие сайта связывания Fkh2предсказаноспомощьюoPossum3.0(http://opossum.cisreg.ca/oPOSSUM3/),простейшим объяснением наблюдаемой токсичности может быть увеличениеколичества Sup35 (Матвеенко и др., 2016).
Стоит отметить, что Abf1 и Reb1 имеютсайты связывания и в промоторе SUP45 (Dagkesamanskaya & Ter-Avanesyan, 1991),что также потенциально может влиять на прионную токсичность.Согласно полученным результатам сверхэкспрессия NRP1, PIN3, CYC8 и PGD1118не оказывает значительного влияния на токсичность приона [PSI+].
Ранее показано,что сверхэкспрессия PAB1 может приводить к антисупрессии, возникающей за счётвлияния белка Pab1 на комплекс терминации трансляции посредством прямоговзаимодействия с Sup35, при этом влияния Pab1 на стабильность [PSI+] или наагрегацию Sup35 выявлено не было (Cosson et al., 2002). В данной работе мыпоказали, что PAB1 очень слабо влияет на синтетическую летальность, и,по-видимому,действительнонеоказываетвлияниянапроявление[PSI+].Антисупрессию, вызванную Pab1 нам не удалось детектировать. Мы также необнаружиливлияниясверхэкспрессииVTS1,чтопротиворечитописаннымаллосупрессорным эффектам той же конструкции (Нижников и др., 2011).
Это,вероятно, связано с отличиями в используемой нами системе тестирования.Интересно, что Mot3 и Gln3 являются потенциально прионогенными белками.При этом точно известно, что Mot3 формирует фактор [MOT3+] (Alberti et al., 2009).В случае Gln3 ситуация не столь очевидна, поскольку новые данные демонстрируют,что полноразмерный Gln3, в отличие от его Q/N-богатого домена, не образуетагрегатов в клетках дрожжей (Антонец и др., 2016). Известны примеры влиянияразных прионов на поддержание друг друга, в частности, появление новых прионовпри сверхпродукции соответствующих белков может оказывать воздействие на [PSI+](Derkatch et al., 2001; Schwimmer & Masison, 2002; Du & Li, 2014) и, как следствие, наего токсичность.
Тем не менее, мы предполагаем, что уровень экспрессии,обеспечиваемый промотором CUP1, не приводит к увеличению содержания в клеткесоответствующих белков, достаточному для их прионизации, а потому мысклоняемся к гипотезе о влиянии Mot3 и Gln3 на синтетическую летальность черезуровень экспрессии SUP35 в клетках.Усиление супрессии при сверхэкспрессии MCM1, GLN3 и MOT3 уже былопродемонстрированоранее(Нижниковидр.,2013),однакомеханизмы,обусловливающие аллосупрессорные свойства этих генов, не изучались. Мыпоказали, что сверхэкспрессия этих генов увеличивает синтетическую летальность, а119также может приводить к усилению транскрипции SUP35.
Увеличение содержанияSup35 в клетках [PSI+] является токсичным (Chernoff et al., 1992). К сожалению, намне удалось зафиксировать увеличение количества белка Sup35 с помощьювестерн-блот гибридизации. Возможно, что чувствительность метода недостаточнадля фиксирования небольших различий в уровне белка, которые, тем не менее, могутоказывать влияние на жизнеспособность клеток дрожжей (Матвеенко и др., 2016).Однако,еслипредположить,чтонаблюдаемоевлияниенасинтетическуюлетальность вызвано именно транскрипционной регуляцией SUP35, то объяснитьэтим усиление супрессии нонсенс-супрессии, наблюдавшееся при сверхэкспрессииэтих генов в работе А.А. Нижникова с соавторами (Нижников и др., 2013)невозможно, так как в этой работе аллосупрессорные свойства MCM1, GLN3 и MOT3проявлялись только когда аллель Aβ-SUP35MC находилась в штамме под контролемпромотора CUP1, а не эндогенного промотора SUP35. При наличии в штаммеSUP35MC под контролем собственного промотора, из всех генов, усилениесупрессии наблюдалось только при сверхэкспрессии MOT3, однако оно былонесравнимо меньше, чем в предыдущем случае.
Стоит отметить, что усилениесупрессии на фоне SUP35MC является неожиданным, т.к. известно, что отсутствиеN-домена в SUP35 приводит к антисупрессии, по крайней мере, на фоне мутацийsup35 и sup45 (Volkov et al., 2007; Kiktev et al., 2007). Поскольку в данной работе мынаблюдали усиление супрессии только в случае MCM1, то влияние сверхэкспрессииGLN3 и MOT3 на синтетическую летальность по-видимому связано с усилениемтоксичности [PSI+], которое может быть вызвано усилением транскрипции SUP35.4.4. Транскрипционный регулятор SFP1 и прионная токсичность [PSI+]Sfp1 является глобальным регулятором транскрипции, регулирующим восновном гены биогенеза рибосом и гены рибосомных белков (Fingerman et al.
2003).Sfp1 активирует эти гены в зависимости, но только на богатых питательных средах(Cipollina et al. 2008). В целом экспрессия SFP1 затрагивает транскрипцию около12010% генов дрожжей (Jorgensen et al. 2004). Существуют данные в пользу того, чтоSfp1 регулирует экспрессию и генов факторов терминации трансляции (Jorgensen etal. 2004; Drozdova et al. 2013). В настоящей работе мы нашли новые свидетельства,подтверждающие участие Sfp1 в регуляции терминации трансляции. Мы показали,что сверхэкспрессия SFP1 оказывает различное влияние на штаммы [PSI+] и [psi-],вызывая сильный токсический эффект у [PSI+], но почти не влияя даже на скоростьроста штаммов [psi-]. Мы показали, что сверхэкспрессия SFP1 приводит к усилениюэкспрессии SUP35 и, мы предполагаем, что это приводит к возникновению[PSI+]-зависимой летальности.Sfp1 содержит три Cys2His2 цинковых пальца и принадлежит к редкому классутранскрипционных факторов с разделёнными цинковыми пальцами, откуда ипроисходит его название (Split-finger protein 1, Sfp1) (Blumberg and Silver, 1991).Первый (N-проксимальный) цинковый палец по-видимому нефункционален, т.к.
егоделеция не влияет на функции Sfp1 (Fingerman et al., 2003, Lempiainen et al., 2009),однако мутации в двух C-терминальных цинковых пальцах сильно нарушают какактивность Sfp1 в регуляции транскрипции (Fingerman et al., 2003), так и егоядерную локализацию (Lempiainen et al., 2009). Эти два цинковых пальца разделены37-ю остатками а-к., в то время как у большинства белков с цинковыми пальцамидлина подобных линкеров всего 8-9 а-к (Xu & Norris, 1998).
Необычная организацияэтих доменов может говорить и об их неканонической функции. В то время какбольшинство транскрипционных факторов, при наличии таковых, используютдомены цинковых пальцев для связывания с сайтами в нуклеиновых кислотах, неясно, справедливо ли это и для Sfp1. Несмотря на то, что показано прямоесвязывание Sfp1 с промоторами некоторых генов рибосомных белков (Jorgensen et al,2004), имеющиеся данные говорят о том, что Sfp1 выступает в качестве непрямогорегулятора транскрипции, т.к.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
