Диссертация (1144823), страница 36
Текст из файла (страница 36)
Настоящая глава посвященакомплексному молекулярно-генетическому анализу штаммовChlamydomonasreinhardtii, мутантных по гену LTS3.3.3.2. Пигментный состав клеток C. reinhardtii, мутантных по гену LTS3Сравнительный анализ пигментного состава клеток мутантов по темновомубиосинтезу хлорофилла: lts3, brc-1, y-7 и штамма дикого типа СС124 (таблица3.22) обнаружил существенные различия в содержании предшественников ХЛ умутанта yellow и штаммов, мутантных по гену LTS3.202Таблица 3.22. Содержание хлорофилла и его предшественниковУсловияГенотип Содержание пигментов (nMol/109клеток)©ростаПП Mg-ПП ПМЭПХЛДХЛДХЛГемкультурCC124светwt0,190,200,18нн3680**Lts3светlts30,410,540,56н89-529*2450**Brc1светbrc10,370,670,39н54-385*2100**Y-7светy-70,2нннн3280CC124темнотаwt0,30,200,080,8н235047Lts3темнотаlts312,00,770,62н18794Brc1темнотаbrc114,00,540,8217,0н8582Y-7темнотаy-70,43нн42,0нн© - в таблице даны средние значения величин, полученных в 3-6 повторностях.
Во всех случаяхошибки не превышают 5%.Условные обозначения: ПП – протопорфирин IX, Mg-ПП – магний-протопорфирин IX, ПМЭ –магний протопорфирин IX-монометиловый эфир, ПХЛД – протохлорофиллид, ХЛД –хлорофиллид, ХЛ –хлорофиллы (a+b); н – наличие пигмента не регистрируется;* - содержание пигмента измеряли в условиях переноса культуры из темноты на свет, так какпри постоянном освещении протохлорофиллид не накапливается.** - содержание гема измеряли в культурах клеток, растущих в темноте, так как на свету онпрактически не накапливается.ШтаммКлетки «желтого» мутанта y-7 при росте в темноте не содержат ХЛ инакапливают только протохлорофиллид, что указывает на блокирование процессапревращения ПХЛД в ХЛД.
В условиях постоянного освещения, по пигментномусоставу они практически не отличаются от штамма дикого типа СС124. Мутантыпо гену LTS3: lts3 и brc-1 в темноте накапливают протопорфирин IX (ПП) ипоследующие в цепи биосинтеза ХЛ пигменты: магний-протопорфирин IX (MgПП), Mg-ПП-монометиловый эфир (ПМЭ) и ПХЛД. При освещении, в ихкультурах появляется промежуточный продукт - хлорофиллид, который в нормене накапливается, что указывает на дестабилизацию комплекса ферментов,осуществляющих превращение ПХЛД в хлорофилл. Клетки световых культурмутантов: lts3 и brc-1 синтезируют ХЛ на уровне штамма дикого типа,выращенного в темноте, и, примерно, на 40%ниже, чем клетки световой203культуры СС124.
Содержание гема в гетеротрофных условиях выращивания умутантов оказалось вдвое выше, чем у дикого типа. По-видимому, в результатемутаций: lts3 и brc-1 в темноте происходят нарушения в цепи биосинтетическихреакций превращения ПП в ХЛ, которые ведут к накоплению его промежуточныхпродуктов. Повышение уровня гема у мутантов может быть обусловленоналичием в их клетках свободных молекул ПП, которые, не будучизадействованы синтезе ХЛ, участвуют в образовании гема.3.3.3. Активность ферментов биосинтеза хлорофиллаАнализ эффективности работы ферментов биосинтеза ХЛ: магний-хелатазы(МХ), магний-протопорфирин IX-метилтрансферазы и АЛК–синтезирующегокомплекса (таблица 3.23) показал, что у мутанта активность МХ сильно снижена втемноте (22% от уровня клеток дикого типа на свету) и восстанавливается насвету (76%) до уровня таковой у клеток дикого типа, выращенных в темноте(79%).
Активности Mg-ПП-метилтрансферазы у мутанта практически одинаковына свету и в темноте, и мало отличаются от штамма дикого типа СС124. В норме(у штамма СС124) работа обоих последовательно-действующих ферментов: МХ иMg-ПП-метилтрансферазы активируется светом, а у мутанта такой активации ненаблюдали для второго фермента.Таблица 3.23. Активность ферментов биосинтеза хлорофилла(условияроста)ГенотипШтамм,CC124 (свет)CC124 (темн.)Lts3 (свет)Lts3 (темн.)wtwtlts3lts3Активность ферментов:Магний-хелатазаMg-ППметилтрансфераза9(nМоль/10 кл )(%)(%)(kat/g)3,23 ± 0,341003,5 ± 0,111002,57 ± 0,18792,7 ± 0,08772,46 ± 0,72763,2 ± 0,06910,72 ± 0,1223,3 ± 0,0794АЛК(% )10060917204Таким образом, у мутанта по гену LTS3 снижена активность МХ в темноте иотсутствует световая индукция фермента Mg-ПП-метилтрансферазы, типичнаядля клеток дикого типа.
Относительная активность АЛК-синтезирующегокомплекса мутантов в отсутствие света также значительно снижена и составляет4-7% от нормы. Подобный эффект описан и для мутантов yellow [Wang et al.,1974]. В обоих случаях, эти данные можно объяснить наличием в клеткахмутантов протохлорофиллида -ретроингибитора синтеза АЛК [Timko, 1998;Armstrong, 1998].3.3.4. Зеленение мутантов: y-7, brc-1 и lts3Зеленение - индуцированный светом процесс биосинтеза ХЛ, характерныйдля покрытосеменных растений, изучали у бесхлорофильных в темноте мутантовхламидомонады: lts3, brc-1 и y-7, измеряя содержание пигмента в их клеткахкаждые два часа после перенесения культур из темноты на свет (рисунок 3.20А).В течение первых 8 часов после освещения темновых культур, ресинтез ХЛнаблюдался только у мутанта y-7.
Хлорофиллы появляются в его клетках после 4часов пребывания на свету, и их содержание быстро увеличивается, достигая засутки 90% от обычного уровня световой культуры. Динамика накопленияпигмента у мутантов brc-1 и lts3 оказалась иной. Их клетки, выращенные втемноте, содержат около 8% ХЛ. После освещения уровень ХЛ несколькоснижается, вместе с уменьшением уровня ПП [Wang et al, 1974], а затем начинаетмедленно возрастать после 48 часов пребывания на свету в культурах штамма lts3и 72 часов ˗ у brc-1. Далее, кинетика синтеза ХЛ становиться сходной с таковой уклеток y-7.
Таким образом, для мутантов, накапливающих ПП в темноте,характерна задержка индуцированного светом синтеза ХЛ. Учитывая, что в этихусловиях время одной генерации для штаммов: y-7, lts3, и brc-1 составляет 20, 23и 27 часов, соответственно, очевидно, что свет активирует синтез ХЛ у мутантовпо гену LTS3 только после первого деления - уже во вновь образованных вусловиях освещения клетках.205АБРисунок 3.20. Динамика накопления хлорофиллов (µМ х 109 клеток) в культуреклеток мутантов и дикого типа при изменении условий освещенности.А - выращенные в темноте клетки были перемещены на свет; Б – световые культурыперемещены в темноту.
Длительность освещения указана в часах. Эксперименты былипроведены в 5-ти повторностях, и ошибки средних не превышают 5%При перемещении в темноту световых культур, кинетика снижения содержанияХЛ у изучаемых штаммов схожа: в течение первых 12 часов темноты их уровеньпрактически достигает значений, характерных для темновых культур (рис. 3.20Б).По-видимому, прекращение светозависимого синтеза ХЛ в гетеротрофныхусловиях происходит одинаково у мутантов и штамма дикого типа, ианализируемые мутации не влияют на этот процесс.3.3.5.
Экспрессия генов ферментов биосинтеза хлорофилловРезультаты изучения транскрипционной активности генов, кодирующихферменты ранних этапов синтеза ХЛ: глутамил-тРНК-редуктазы (ген GTR),глутамат-полуальдегидаминотрансферазы (ген GSA), АЛК-дегидратазы (генALAD) и магний–хелатазы (гены: CHLH, CHLD и CHLI) в культурах мутантов иштамма дикого типа, растущих в разных условиях освещения, представлены нарисунке 3.21. В отличие от дикого типа, у темновых культур мутанта lts3 неудается обнаружить транскрипты генов: GSA, CHLH, CHLI и CHLD, а у штамма206y-7 их уровень снижен. Перенос на свет темновых культур, в норме (штаммСС124) уже через 1,5-2 часа вызывает индукцию экспрессии этих генов, которая кчетырем часам достигает своего максимума.
Для мутантов же характернавременная задержка активации транскрипции (у штамма y-7 она составляетпримерно 1-2 часа, тогда как у lts3 – более 2-х часов). Уровень экспрессиианализируемых генов в световых культурах мутанта сходен с таковым у штаммадикого типа, а в случае генов: GTR, CHLH и CHLD, - превышает его.Синтез белков большой (H) и малой (I) субъединиц МХ у штамма дикого типаи мутанта lts3 (рисунок 3.22) полностью соответствует динамике накоплениямРНК этих генов, свидетельствуя, что регуляция их экспрессии происходит науровне транскрипции. Таким образом, у мутанта по гену LTS3 по сравнению склеткамиРисунок 3.21.
Транскрипция генов, контролирующих биосинтез хлорофилла умутантов с нарушениями темнового синтеза. Аликвоты (10 µg) тотальных РНКиз штамма дикого типа СС124 и мутантов: lts3 и y-7, использовали для Нозернблот гибридизации с фрагментами кДНК анализируемых генов. Уровеньтранскрипции этих генов определяли в культурах, выращенных в темноте (ПТ), насвету (ПС) и в условиях освещения растущих в темноте культур. Контроль - пробык гену Rbcs2 малой субъединицы рибулозобифосфаткарбоксилазы207дикого типа в темноте снижена транскрипция генов, кодирующих МХ и ферментглутамат-полуальдегидаминотрансферазу (GSA-AT), входящего в состав АЛКсинтезирующего комплекса.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
