Диссертация (1144823), страница 34
Текст из файла (страница 34)
Быловысказано предположение [Walker and Willows. 1997], что Mg2+ связывается ссубъединицей H через остатки гистидина (Н), формируя гистидин- Mg2+протопорфирин IX комплексы. В последовательности белка CHLH оказалось триостатка гистидина, которые сохраняются у всех известных объектов: H664, H668 иH813 (рисунок 3.18).Филогенетический анализ белков большой субъединицы МХ показал, чтоих общим предшественником является CobN – кобальт-хелатаза прокариот(рисунок 3.19). Молекула белка CHLH содержит общий для всех изученныханалогичных белков консервативный домен, идентичный субъединице CobNкобальт-хелатазы из Pseudomonas denitrificans. Она необходима для синтезакобириновой кислоты – кобальт-содержащего циклического тетрапиррола, предшественника витамина В12.
Этот домен занимает большую часть молекулы ˗от аминокислоты 338 до ее С-конца. Еще в 1992 году было показано [Laurent et al,1992], что CobN имеет строгое сродство к гидрогенобиридовой кислоте –производной протопорфирина IX. Позднее выяснилось, что BchH из Rodobactersphaeroides имеет строгое сродство к протопорфирину IX (ПП) [Willows et al.,1996]. Первое указание на то, что субъединица H имеет свойство связывания сПП, было получено в экспериментах по исследованию каталитической активностифермента in vitro c использованием трех субъединиц: H, I, и D из Synechocystis sp.PCC6803 [Jensen et al., 1998]. Преинкубирование белка CHLH с ПП до началаферментативной реакции приводило к укорочению lag-фазы в процессе191Рисунок 3.18. Сравнительный анализ аминокислотной последовательностибелка CHLH C.
reinhardtii. Элаймент белка CHLH C. reinhardtii с ортологами изследующих объектов: Synechocystis PCC6803 (chlH, acc. S75000), Rodobactersphaeroides (bchH, acc. CAM38723), Antirrhinum majus (Olive, acc. S37310),Arabidopsis phaliana (CHLH, acc. S71288), Nicotiana tabacum (CHLH, acc. T01789),Hordeum vulgare (Xantha-f, acc. S64721), Glycine max (CHLH, acc. T07126).Условные обозначения: (*) - остаток, консервативный для всех изученныхобъектов; (:) - консервативный остаток аминокислоты. Аминокислоты, междукоторыми происходит отрезание транзитного пептида, - подчеркнуты; Стартовыйкодон – метионин в молекуле белка chlH у Synechocystis PCC6803 выделенполужирным штифтом.
Три консервативных остатка гистидина (H) выделенырамкой, а три консервативных цистеина (С) - полужирным шрифтом192формирования продукта реакции. Затем было показано, что связывание с ППизменяет флуоресцентные свойства белка [Karger et al., 2001]. К настоящемувремени сайты связывания протопорфирина IX в молекуле CHLН магнийхелатазы окончательно не определены. Данные о том, что модификации остатковцистеина нарушают связывание, послужили основой предположения о важнойроли этой аминокислоты во взаимодействии с субстратом [Jensen et al., 2000].Наиболее консервативными (то есть встречаются у всех известных гомологов) ваминокислотной последовательности CHLH оказались три остатка: С784, С963 иС1104.Используя программные ресурсы для анализа белков, мы исследовали влияниемутаций chl1 и brs-1 на структуру белков CHLH.
Мутация chl1 представляетсобой инсерцию одного нуклеотида (С) в положении 2661 геномного сиквенса вэкзоне 9 (что соответствует позиции 1577 мРНК), которая приводит к сдвигурамки считывания и появлению стоп-кодона через 22 триплета (рисунок 3.14). Врезультате трансляции мутантный белок с молекулярной массой 52,16 kDaсодержит 479 ак, из которых последние 22 ак не гомологичны белку дикого типа,и консервативному домену CobN. Область их гомологии составляет 118аминокислот и находится между аминокислотами 338 и 457.Мутация brs-1 представляет собой инсерцию нуклеотида в позиции 3151 экзона10 геномного сиквенса (соответствующей позиции 1776 мРНК). В результатесдвига рамки считывания стоп-кодон появляется через 164 триплета послевставки нуклеотида.
Трансляция этой мРНК ведет к образованию укороченногополипептида длиной 721 ак и молекулярной массой 78,6 kDa. Мутантный белокгомологичен CoN-домену в области между позициями 338 и 559 ак. Повидимому, укороченные белки, транслируемые с мутантных мРНК (479 ак и 721ак, соответственно, вместо 1388 ак у дикого типа) нестабильны и быстродеградируют после своего появления.193Рисунок 3.19. Филогения белков большой субъединицы магний-хелатазы.Элаймент последовательностей аминокислотных остатков белков субъединицыCHLH магний-хелатазы проводили с помощью программы Multaline(http://multalin.toulouse.inra.fr/)3.2.7. Обсуждение результатовМутации в генах большой субъединицы магний-хелатазы.
Основнаяинформация о генетическом контроле и функциях ключевого ферментабиосинтеза хлорофилла (ХЛ) магний-хелатазы (МХ) была получена при изучениибесхлорофилльныхмутантоврастенийимикроорганизмов.Мутации,блокирующие функции большой субъединицы этого фермента описаны длямногих объектов (табл.3.21). Наиболее масштабными стали работы по анализупигментных (бесхлорофилльных) мутантов ячменя (Hordeum vulgaris). В общейсложности, было изолировано 357 пигментных мутантов, изучение которыхдлиться уже более 40 лет. В гене Xantha-f, кодирующем H-субъединицу МХ былоописано8мутаций,молекулярно-генетическаяприродакоторыхбылаустановлена к 2005 году. Не все мутации в гене большой субъединицы МХ(таблица 3.21), приводят к отсутствию функционального белка CHLH.194Таблица 3.21.
Мутации в гене, кодирующем большую субъединицу МХфенотипМолекулярная природаХЛбелокЯчмень (Hordeum vulgaris), CHLH – 1381 акxanth-f-10нетДелеция 3-х нуклеотидов – потеря Е434xanth-f-2610%+Замена M632Rxanth-f-27Делеция 14 нп-frameshift, белок - 1104акxanth-f-40Делеция 2 нп frameshift, белок - 899 акxanth-f-41+Делеция 12 нп – потеря ALQV(439-442)xanth-f-58Крупная делецияxanth-f-60следы+Миссенс мутация – замена P393Lxanth-f-68Миссенс мутация – замена G794EАрабидопсис (Arabidopsis thaliana), CHLH - 1381 акcchЗамена (C-T), - P642LMochizuki20%etal., 2000gun5+Замена (C-T) – A990V60%Хламидомонада (Chlamydomonasreinhardtii) CHLH – 1399 акbrs-1Вставка (+С) - frameshift, белок 721акChekunovaat al., 2001chl1Вставка (+Т) - frameshift, белок 479 ак*- Ссылки на литературу даны в последней графе; ак – аминокислотные остатки;(+) - означает наличие пигмента или белка, а (-) – отсутствие.Olsson et al., 2004*МутацииВ клетках изучаемых нами мутантов chl1 и brs-1 C.
reinhardtii вместополноценного белка CHLH из 1399 аминокислотных остатков синтезируютсякороткие пептиды, содержащие только первые 457 и 559 аминокислотныхостатков, соответствующих последовательности белка CHLH дикого типа.Согласно современным представлениям о функционировании фермента МХ икаталитических свойствах белка большой (H) субъединицы, для связывания ионовмагния Mg2+ и молекул субстрата – протопорфирина IX существенными могутбыть следующие остатки гистидина: H664, H668, H813, и цистеина: С784, С963, С1104,соответственно [Jensen et al., 2000]. Все они отсутствуют в мутантных белках.Вероятно, потеря функционально значимых участков в этих белках иобусловливаетихбыструюдеградациювклеткехламидомонадыи,соответственно, наблюдаемый фенотип мутантов chl1 и brs-1. В гене Xantha-fячменя к мутациям, препятствующим формированию белка CHLH относятся:потеря аминокислоты в позиции 343 (f-10), синтез укороченных белков (f-27 и f-19540), а также замена аминокислоты в позиции G794E.
У арабидопсиса дляблокирования функций МХ оказались существенны замены аминокислот впозициях P642L и A990V, которые также привели к формированию GUNфенотипа, возникающего в результате нарушения ретроградной регуляциибиосинтеза ХЛ.У всех фотосинтезирующих эукариот процессы хлорофиллобразования находятсяпод комплексной регуляцией. Один из основных ее механизмов состоит вкоординации экспрессии ядерных и хлоропластных генов, продукты которыхучаствуют в фотосинтезе.
Полагают, что ядро и хлоропласт «обмениваютсяинформацией»черезсистемупередачисигнала(plastid-to-nucleussignaltransduction). В норме, блокирование биогенеза хлоропластов приводит кгенерации «хлоропластного сигнала», который, попадая в ядро, подавляетэкспрессию ядерных генов. Искусственное блокирование биогенеза хлоропластадостигаетсяингибиторомпутемобработкибиосинтезахлоропластахнарастенийкаротиноидов.светуначинаютсяарабидопсисаВотсутствиипроцессынорфлюразоном–каротиноидов,вфотоокисленияилифотообесцвечивания, которые ведут к подавлению экспрессии ядерного генаLHCB1, кодирующего белок светособирающего комплекса фотосистемы 1.
Такимобразом, в норме, у растений, обработанных норфлюразоном, на светурепрессирована экспрессия этого гена в результате функционирования ―системыпередачи сигнала хлоропласт-ядро‖. Для выяснения вопроса, - какова природа―пластидного сигнала‖, блокирующего экспрессию ядерных генов в ответ надисфункцию хлоропласта, -были изолированы мутанты арабидопсиса снарушениями этого ―сигнального пути‖, названные GUN – genomes uncoupled[Susek et al., 1993]. Фенотип этих мутантов состоит в высоком уровнетранскрипции ядерных генов LHCB1 и RBCS в условиях освещения обработанныхнорфлюразономрастений,илиотсутствиинормальнойрепрессиигеновфотосинтетического аппарата хлоропласта в условиях его деструкции, иобусловлен мутациями в 5-ти генетических локусах: GUN1-GUN5. Мутации gun5196и cch оказались аллелями гена CHLH арабидопсиса у которого замены A990V иP642L, соответственно, обеспечили «GUN-фенотип», то есть отсутствиехлоропластного сигнала, блокирующего экспрессию генов ядра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
