Диссертация (1144823), страница 32
Текст из файла (страница 32)
При сравнении аминокислотныхпоследовательностейбелковыхпродуктовэтихгеноввыбрали2консервативный участка: FGYEGDPM (624-631) и LEFMPGRQ (670-677),которые стали основой для создания дегенеративных праймеров (в скобкахуказаны позиции аминокислот в соответствии с сиквенсом гена CHLH ячменя):5‘-TT(CT)GG(ACTG)TA(CT)GAGGG(ATGC)GA(CT)CC(AGCT)-3;5‘-CTG CTTA(ACGT)CC(ACGT)GGCAT(AG)AA(CT)TC-3‘.Эти праймеры использовали для ПЦР на матрице тотальной ДНК, выделенной изклеток штамма дикого типа хламидомонады. Полученныйфрагмент ДНКразмером 162 нп был клонирован в TA-cloning вектор PCRII (Invitrogen) исеквенирован. Нуклеотидная последовательность этого ПЦР-фрагмента оказаласьгомологичной (100%) последовательности фрагмента гена Xantha-f ячменя,соответствующей последовательности аминокислот 624-677.
Этотфрагмент ДНК (162 пн) послужил зондом при скрининге кДНК библиотеки,сконструированной на основе мРНК, выделенных из вегетативных клеток штаммадикого C. reinhardtii, в составе HM149, которую любезно предоставил проф.Роше (J-D. Rochaix, University of Geneva, Switzerland). В результате были отобраны2 позитивных фаговых клона, содержащих фрагменты ДНК размером 1,4 тпн и1783,1 тпн. Они были амплифицированы методом ПЦР и субклонированы в векторpGEM-T (Promega) для секвенирования.
Нуклеотидная последовательностьфрагментаразмером3,1тпнсодержалакороткийполи-Aхвостивнепосредственной близости от него сигнал полиаденилирования TGTAA.Последовательность длиной800 нуклеотидов«выше по течению» от этогосигнала была гомологична генам, кодирующим H-субъединицу МХ. Фрагментразмером 1,4 тпн на своем 3‘-конце содержал 200 пн, перекрывающихся сначалом первого фрагмента, и область кДНК гена МХ «выше по течению»,однако не включал начала гена. Для поиска 5‘-конца кДНК гена CHLH былпредпринятповторный скрининг кДНК библиотеки, которыйне далположительных результатов, после чего была использована система 5‘RACE(rapid amplification cDNA ends), позволяющая амплифицировать 5‘-концевыеучастки кДНК. Используя 2 специфических праймера, синтезированных по 5‘концевомуучасткуфрагментаразмером1,4тнп:5‘CTCCAGCTTCTCCGAGTTACC-3‘ и 5‘-AGCAGGTTCTCCAGGTTGTCC-3‘, ианхор-праймер5‘-GGCCACGCGCCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3‘,был получен кДНК фрагмент размером 605 нп, содержащий последовательность,лежащую «выше по течению» фрагмента размером 1,4 тнп кДНК гена CHLH.Этот фрагмент был субклонирован в pBluescriptIISK+ (Stratagene) и секвенирован.Для проверки того предположения, что фрагмент ДНК размером 605 пнсодержит 5‘-конец гена CHLH, был осуществлен скрининг геномной библиотекихламидомонады, сконструированной в EMBL3 (Goldschmidt-Clermont, 1986), сэтим фрагментом в качестве зонда.
Фаговые ДНК из 3-х позитивных клонов былипорезаны рестриктазами: SalI/PstI иSalI/SmaI, перенесены на нейлоновуюмембрану и гибридизированы сначала с 5‘-RACE фрагментом, а, затем, послеотмывки мембран, с пробами из кДНК фрагментов размером 1,4 и 3,1 тнп.Рестрикционный фрагмент размером 1,75 тнп, который гибридизовался с 5‘RACE фрагментом, но не с остальными двумя зондами, был выделен изагарозного геля, очищен, (JET sorb kit, Genomed), и субклонирован в pBluescript179Полученние ПЦР-фрагмента кДНК гена CHLH C.
reinhardtiiСравнительный анализ аминокислотных последовательностей четырех известных белков H-субъединицымагний-хелатазы из бактерий Rodobacter capsulatus (BchH) и Synechocystis PCC6803 (chlH), ячменя (ген Xantha-f) ильвиного зева (ген Olive). Выбор 2-х консервативный участков: FGYEGDPM (624-631)* и LEFMPGRQ (670-677)*для создания дегенеративных праймеровПЦР на тотальной ДНК из клеток штамма дикого типа хламидомонады с синтезированными дегенеративнымипраймерамиПолучение ПЦР-фрагмента кДНК размером 162 нп.Его субклонирование в TA-cloning вектор PCRII (Invitrogen) и секвенирование показало 100% гомологию сучастком кДНК гена Xantha-f, соответствующего последовательности аминокислот фрагмента (624-677)*.Поиск кДНК фрагментов гена CHLH в библиотеке кДНК C. reinhardtiiСкрининг кДНК библиотеки с ПЦР-фрагментом размером 162 нп.
Отбор позитивных фаговых клонов.ПЦР-амплификация фрагментов ДНК хламидомонады из позитивных фаговых клонов, ихсубклонирование в вектор pGEM-T (Promega) для секвенирования.Нуклеотидные последовательности двух фрагментов ДНК размером 1,4 тпн и 3,1 тпн имели областьперекрывания (200 нп) и показали высокую степень гомологии с известными сиквенсами генов H-субъединицмагний хелатазы.Клонирование 5’-конца кДНК гена СHLH(5‘RACE - rapid amplification cDNA ends).
Получен ДНК-фрагмент размером 601 пн., субклонирован вpBluescriptIISK+ (Stratagene) и секвенирован.Поиск 5’-конца геномного сиквенса CHLHСкрининг геномной библиотеки (EMBL3), с 5‘RACE-c фрагментом (605 пн) в качестве зонда.Фаговые ДНК из 3-х позитивных клонов порезаны рестриктазами: SalI/PstI и SalI/SmaI, перенесенынанейлоновую мембрану и гибридизированы, сначала с 5‘-RACE фрагментом, а, затем, после отмывки мембран, спробами кДНК фрагментов размером 1,4 и 3,1 тпн.Выделение из агарозного геля рестрикционного фрагмента размером 1,75 тнп, который гибридизовался с5‘-RACE фрагментом, но не с остальными двумя зондами, очистка с использованием JETsorbkit (Genomed),субклонирование в pBluescriptIISK+ (Stratagene) и секвенирование.Нуклеотидная последовательность 1,75 пн- фрагмента содержит ОРС, гомологичную субъединице CHLH,прерываемую множеством интронов.Определение интрон-экзонной структуры 1,75 пн- фрагмента гена ChlH при сравнении его сиквенса и ESTфрагмента размером 445 нп, из EST-библиотеки /AccessionNAV394213; Asamizuetal., 1999/Получение полного нуклеотидного сиквенса кДНК гена CHLHхламидомонады (5054 пн)в результате комбинирования нуклеотидных последовательностей всех ДНК-фрагментов (рис.1б).Получение полного геномного сиквенса гена CHLH хламидомонады (7035 пн).ПЦР-амплификация фрагментов ДНК гена ChlH, по матрице геномной ДНК дикого типа с (proofreading) ДНКполимеразы (Pfu-TurboDNA polimerase, Stratagene) и 6-ти пар праймеров, синтезированных по нуклеотиднойпоследовательности кДНК ChlH, их субклонирование и секвенирование.Рисунок.
3.11А. Схема реконструкции гена CHLH и его интрон-экзонной структуры.* - В скобках - позиции аминокислот в соответствии с сиквенсом гена Xanth-f ячменяIISK+ (Stratagene) для секвенирования. Его нуклеотидная последовательностьсодержала ОРС, гомологичную последовательности гена CHLH, прерываемую180интронами.
Области экзонов и интронов в этом фрагменте были установленыпутем сравнения нуклеотидных последовательностей его геномной ДНК и ESTфрагмента размером 445 пн (Accession N AV 394213), из EST-библиотеки,созданной к тому моменту [Asamizu et al., 1999]. Этот EST-фрагмент имел общиеучастки с 5‘-RACE фрагментом. Основываясь на их последовательностях,определили начало кодирующей последовательности и установили стартовыйкодон транскрипции. Комбинируя нуклеотидные последовательности всех ДНКфрагментов, получили полную кДНК гена CHLH хламидомонады (5054 пн).Рисунок 3.11Б. Стратегия клонирования гена CHLH большой субъединицымагний-хелатазы C. reinhardtii – реконструкция.Геномная ДНК гена CHLH хламидомонады была амплифицирована в видеПЦР-фрагментов, полученных на матрице геномной ДНК штамма дикого типаСС124 хламидомонады с использованием безошибочной (proofreading) ДНКполимеразы (Pfu-Turbo DNA polimerase, Stratagene).
По последовательностикДНК были синтезированы праймеры для получения 6-ти перекрывающихсяфрагментов геномной ДНК (таблица 3.20). Эти ДНК-фрагменты, размерыкоторых варьировали от 0,7 тпн до 1,6 тпн, были субклонированы в pGEM-Tвектор, секвенированы, и использованы для реконструкции гена CHLH.Выявление его интрон-экзонной структуры осуществляли путем сравненияпоследовательностей ДНК и кДНК (рисунок 3.12).
Отсутствие интронов в 3‘UTRтакжебылоустановленометодомПЦР.Полученныенуклеотидныепоследовательности кДНК и геномной ДНК гена CHLH, кодирующего большую181субъединицу МХ C. sreinhardtii, были депонированы в базе данных EMBL подномерами: AJ307054 (CHLH сDNA) и AJ307055 (CHLH gene).Таблица 3.20. Праймеры, использованные для секвенирования гена CHLHПЦРфрагментПраймеры123456AACTAGGGAGGGGCAACAATGAAGATGTTGGCAGAGGCCGCCAACATCTTCATCGGCTCGCTGTTGACGGGGTCGGAGAATCCGACCCCGTCAACAAGTGGCTGCACGCCGATGAAGACGCGTCTTCATCGGCGTGCAGCCGCGGCCTGAGTGCCAATCACGGACGCCCTGGACCCTCAGTCAACCACAACCCGCCAACTCGTGGAGGACAAGATTGTCCGAGGGAGCCGTGAGДли-на(пн)211822191921211818191717Полодение накДНК- 23+485+454+1153+1133+1913+1893+3056+3020+4244+4170+4967Длина ПЦРфрагмента (пн)cDNA genomic50894372915357809651163133512241376797797Рисунок 3.12.
Структура гена CHLH C. reinhardtii (7035 пн). Темные области экзоны, белые – интроны. 5‘UTR и 3‘UTR –прямоугольники меньших размеров.Указаны положения инициирующего кодона (ATG), стоп-кодона (TAA), сигналаполиаденилирования (TGTAA) и мутаций (+1 frameshift) chl1 и brs-1Проверку копийности гена CHLH осуществляли методом Саузерн-блотанализа (рисунок 3.13). Геномная ДНК, выделенная из штамма дикого типа, былапорезана4-мяферментамирестрикции,которыенеимеютсайтоввпоследовательности гена СHLH, или этот сайт расположен на концевом егоучастке, перенесена на мембраны и гибридизована с фрагментами кДНК этого182гена.Единичныесигналыгибридизациидемонстрируют,чтовгеномехламидомонады существует одна копия гена СHLH.Рисунок 3.13.
Анализ геномной ДНК C. reinhardtii по Саузерну. 800 нг геномнойДНК, выделенной из штамма дикого типа СС124, обработано рестриктазами: Sal1 –дорожка 1; HindIII – дорожка 2; BamH1 – дорожка 3; SmaI – дорожка 4. Длягибридизации использовали 32P-меченые фрагменты кДНК гена CHLH C. reinhardtii3.2.2. Идентификация мутантных аллелей: chl1 и brs-1 гена CHLHДляпоискамутацийchl1иbrs-1фрагментыгенаCHLHбылиамплифицированы методом ПЦР на матрицах ДНК, выделенных из мутантныхштаммов СС1482-2е (генотипа chl1) и brs-1, 6-ти пар праймеров, которыеприменялись для амплификации аллели дикого типа этого гена (таблица 3.20), и―безошибочной‖ ДНК-полимеразы (Pfu-Turbo DNA polimerase, Stratagene).Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена CHLH у штаммадикого типа мутантов обнаружил у мутанта chl1 инсерцию одного нуклеотида (С)в позиции 2661 в экзоне 9 (рисунок 3.12).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
