Диссертация (1144823), страница 30
Текст из файла (страница 30)
ХОМ скрещивали с ауксотрофными и множественномаркированными линиями C. reinhardtii и анализировали потомство методомтетрадного анализа. Результаты демонстрировали отсутствие сцепление мутацийв гене LTS3 с маркерами VI, X и XI групп сцепления, а для мутаций в гене CHL1отсутствие сцепления показано для маркеров I, IV, X, и XI хромосом C.reinhardtii.ХОМ скрещивали (С1489 и С1495) со штаммами А-3 и М-3 – дисомиками поVI и I группам сцепления, соответственно. Дисомики используются длялокализации генов в хромосомах [Mortimer and Hawthorne, 1973]. Их скрещиваютс гаплоидами, несущими нелокализованную мутацию, и учитывают расщеплениетрисомного гибрида (++-). Отклонение от менделевского расщепления 2+ : 2- поанализируемому маркеру служит подтверждением дисомии [Горденин, 1976].Такие отклонения по маркерам chl1-19 и or13 в потомстве С1489 и С1495 говорятоб их возможной локализации в VI, и I группах сцепления (соответственно), или отом, что родительские штаммы А-3 и М-3 являются дисомиками и похромосомам, несущим гены CHL1 и LTS3, соответственно.
Мейотическое167расщепление анеуплоидов-трисомиков (++-) также было использовано дляопределения расстояний анализируемых маркеров от своих центромер анеуплоидия ведет себя как маркер, абсолютно сцепленный с центромерой.Частота рекомбинации (fII) на участке ген-центромер определяется как частотатетратипов в сочетании исследуемого маркера и анеуплоидии (n+1) среди тетраддиплоида-трисомика, и, без учета множественных обменов, расстояние междугеном и центромерой определяется как 0,5 fII, [Горденин, 1978].Анализклассическиймитотическогометодрасщеплениягенетическогогетерозиготныханализа.Диплоидыгибридов–(дисомики),гетерозиготные по изучаемым маркерам, оказались нестабильны.
Нестабильностьпроявляется в высокой частоте появления секторных (зеленый/оранжевый)колоний (2-24 x 10-2) при их вегетативном размножении. Для C.reinhardtiiпоказано, что причинойнестабильности диплоидов является митотическаярекомбинация, нерасхождение, гемизиготизация или гаплоидизация, причем, УФоблучение увеличивает частоту митотической рекомбинации и не влияет нанерасхождение [Lee et al., 1976; Martinek et al., 1969; 1970]. При этом, сегрегация вбольшей степени является результатом митотической рекомбинации, хотя частотапостмейотической сегрегации может быть увеличена за счет хромосомныхделеций [Eves and Chiang, 1982].
Высокая частота совместной сегрегации мутацииor13 и маркера I группы сцепления msr-1, позволила сделать заключение об ихтесном сцеплении. Увеличение частоты секторных колоний при УФ-облучениигетерозгот or13/or13+ (таблица 3.8) подтверждает, что причина сегрегации –митотическая рекомбинация.В ряде скрещиваний (С1433, С1495) наблюдалась высокая частотаобразования вегетативных диплоидов. Для скрещиваний с участием or13мутантов и штаммов, несущих мутации аргининзависимости arg7 и устойчивостик эритромицину ery3, частота появления таких диплоидов достигала 100%, тогдакак в норме она не превышает 2-4% [Ebersold, 1967]. Диплоидность культурможет быть подтверждена цитологическими и генетическими критериями:168средний объем клетки, тип спаривания mt-, характер расщепления прискрещивании их с гаплоидами и диплоидами.
Показано, что объем клеткипропорционален содержанию ДНК в ядре и изменяется соответственноувеличению числа наборов хромосом [Косиков и др., 1975; Матюшина, 1964]. Увегетативных диплоидов хламидомонады он в 2-2,5 раза выше, чем у гаплоидов, иони имеют тип спаривания mt-, который доминирует в гетерозиготе: mt-/mt+[Ebersold,1969;Чемерилова,1978].Среднийобъемклетокпотомстваскрещивания С1501 составлял 209 – 240 мкм3, и они имели тип спаривания mt-.Гетерозиготность по мутации or13, такжеслужилаподтверждением ихдиплоидности.Хлорофиллы в фотосинтезирующей клетке формируется в результате цепипоследовательных ферментативных реакций, и для обнаружения звеньев этойцепи, контролируемых генами CHL1 и LTS3, у мутантов по этим генам былосуществлен анализ ХЛ и их предшественников. Качественный и количественныйсостав пигментов в клетках C.
reinhardtii определяли методами хроматографии (отбумажной хроматографии до HPLC) и спектроскопии (от абсорбционнойспектроскопии до индукции флуоресценции). Хотя данные по уровню содержанияпредшественников ХЛ, полученные с применением флуоресцентных методов,количественно отличаются от результатов HPLC-анализа (таблицы 3.17 и 3.18),существенных качественных различий между ними обнаружено не было.Установлено, что светочувствительные мутанты по гену CHL1 в темноте несинтезируют ХЛ и способны накапливать только одинего интермедиат –протопорфирин IX (ПП) ˗ общий предшественник гема и ХЛ. Причиной высокогоуровня содержания гема (5-ти кратно увеличенного по сравнению со штаммомдикого типа) как у штамма генотипа chl1-19 из ПГК, так и у мутанта brs-1, могстать блок хлорофильной ветви - весь пул молекул ПП оказался задействован всинтезе гема.Протопорфирин IX (ПП) в цепи синтеза ХЛ является субстратом дляфермента магний-хелатазы (МХ), который встраивает ионы магния Mg2+ в169молекулы ПП с образованием Mg-ПП (рис.
3.9). Накопление химически чистогоПП в клетках chl1-мутантов послужило указанием, что у них генетическизаблокирован процесс включения магния в молекулу ПП, и мутации в гене CHL1нарушают функционирование МХ. По-видимому, ген CHL1 или кодирует этотфермент, либо регулирует его активность.Для ответа на вопрос, ˗ влияют ли мутации в генах CHL1 и LTS3 на работуферментовраннихэтаповБХ,˗проверялиактивность:МХ,Mg-ПП-метилтрансферазы и АЛК–синтезирующего комплекса в клетках штаммов дикоготипа и ХОМ хламидомонады. Эти эксперименты позволили установить, что умутанта по гену CHL1 МХ практически не функционирует. МХ – этоэнзиматический комплекс, состоящий из трех субъединиц: H, D, и I, кодируемых,соответственно, генами: CHLH, CHLD и CHLI. Чтобы найти субъединицу,контролируемую геном CHL1, был осуществлен иммуноблоттинг белков,выделенных из анализируемых штаммов, с гетерологичными антителами ко всемтрем субъединицам.
Результаты показали отсутствие одного белка – субъединицыH в клетках chl1-мутантов.Первая информация о генах, кодирующих МХ, была получена послеобнаружениягеномногофрагмента хромосом бактерийRhodobacter (R.)capsulatus и R. sphaeroides размером ок. 46 тпн, названного ―фотосинтетическийгенный кластер‖, который содержит если не все, то основные гены,контролирующиемагниевуюветвьбиосинтезабактериохлорофиллаикаротиноидов [Yen and Marrs, 1976; Marrs 1981].К моменту начала описанных выше экспериментов (1996 год, Гатерслебен)уже было известно, что МХ Rhodobacter capsulatus кодируют 3 гена: bch H, bchI иbchD [Bollivar et al., 1994].
Изучение экспрессии этих генов в E.coli показало, чтовсе три белковых продукта (с молекулярной массой: 120, 40, 70 kDa,соответственно) необходимы для ферментативной активности [Gibson et al., 1995;Willows et al., 1996]. Подобная работа была выполнена и для генов-ортологовChlI, ChlD и ChlH цианобактерии Synechocystis PCC6803 [Jensen et al., 1996a]. Их170белковые продукты, хорошо различимые на SDS-полиакриламидном геле, имелимолекулярную массу примерно 40, 70 и 150 kDa, соответственно, котораяполностьюсовпадаластаковой,рассчитаннойпонуклеотиднойпоследовательности. Авторы также показали, что для ферментативной активноститребуется наличие белковых продуктов всех трех генов и АТФ.
Первый генрастений, контролирующий биосинтез ХЛ, был обнаружен при изученииРисунок 3.9. Схема биосинтеза хлорофиллов (ХЛ). Строчными буквамиуказаны мутации, блокирующие этапы биосинтеза. Заглавными буквамиобозначены ядерные гены ферментов: GTR – глутамил-тРНК-редуктазы;GSA – глутамат-1-полуальдегидаминотрансферазы; ALAD – АЛКдегидратазы, CPX – копропорфириноген III-оксидазы; PPX –протопорфириноген IX-оксидазы; субъединиц магний-хелатазы: CHLH,CHLD, CHLI; POR – светозависимой НАДФH: ПХЛД-оксидоредуктазы(сПОР); CAO – ХЛа/хлорофиллид а-оксидоредуктазы. Хлоропластные гены:trnE кодирует глутаминовую тРНК, а гены: chlB, chlL и chlN - субъединицытПОР.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
