Диссертация (1144823), страница 28
Текст из файла (страница 28)
Их частоты не превышают 16%, что также подтверждаетгипотезу о дисомии по маркеру or13 [Инге-Вечтомов, 1971]. Изучениемитотической сегрегации (гомозиготизации) дисомиков 1495-10а и 1495-10б помаркеру ery3 группы сцепления I и мутации оранжевости or13 (таблица 3.15)Таблица 3.14. Анализ нестабильности анеуплоидов-дисомиков генотипа:or13/or13+Штамм1495-10а1495-10б1495-56а1495-56гГенотиппо мутацииоранжевостиor13or13/or13+, mt+or13/or13+, mt+or13/or13+, mt+or13/or13+, mt+Частота секторных.
колоний (10-2)Митотическая сегрегация,индуцированная УФ-излучением (дж/м2):078015601,216,633,11,9н.о.50,02,215,040,03,118,0-Мейоз16,214,113,612,4показало высокую частоту их совместной сегрегации, свидетельствующую отесномгенетическоманеуплоида-трисомикасцеплении.(++-)иТакимизучениеобразом,анализмейотическойирасщеплениймитотическойнестабильности дисомиков генотипа: or3/or3+ позволили с высокой степеньювероятности предположить, что локус LTS3 картируется в группе сцепления I, на154расстоянии 30 сМ от своей центромеры, и близко сцеплен с локусом ERY3,картированном в 31 сМ от центромеры [Harris, 1989].Таблица 3.15. Митотическая гомозиготизация дисомиков по группесцепления I C.
reinhardtii генотипа: or13,ery3,msr-1/or13+,ery3+,msr-1+ШтаммЧастота выщепления клонов (x 10-2) фенотипа:P(Ho)Оранжевых Устойчивых к Совместная сегрегацияэритромицину эксперимент Теория (Ho)*1495-10а1,205,82***94,01%0,07 0,0011495-10а **16,6121,0499,12%3,49 0,0011495-10б1,886,0394,04%0,11 0,001Ho – гипотеза о свободной рекомбинации маркеров;** -представлена частота выщепления в условиях УФ-облучения;*** - зеленые сегреганты устойчивы к эритромицину на свету, в темноте – на средес антибиотиком они не растут.Мутации локуса CHL1 не сцеплены с маркерами I, X, XI хромосом (таблица3.9).
В потомстве скрещивания С1489 (chl1 x act2,pf14,msr1,mt-) наблюдалосьнерегулярное расхождение по мутации chl1 и маркерам хромосомы VI, применделевском наследовании маркера msr1 хромосомы I. Для оценки растояниялокуса CHL1 до центромеры, скрещивали гетерозиготы генотипа: chl1-19/+,pf14/+, mt-/mt+ на штаммы дикого типа, конструируя зиготы-трисомики (++-), ирасчитывали fII, которая соответствует частоте появления тетрад типа: 3+ : 1(таблица 3.16). Расстояние ген-центромер, определяемое как 0,5 fII, для маркераchl1-19 оказалось равным 5,0-5,8 сМ. Для маркеровpf14 и mt с известнойлокализацией эти расстояния составляют 11,5 и 20,0 сМ, что соответствуетданным литературы - 12 и 24 сМ, соответственно [Harris, 1989].155Таблица 3.16. Тетрадный анализ потомства скрещиваний штаммов,гетерозиготных по мутации chl1-19 и маркерам хромосомы VI на штаммдикого типаШифрзиготмаркерыС1515chl1-19pf-14chl1-19chl1-19pf14mtС1520С1523Число тетрад с расщеплением:1+:0- 3+:1- 2+:2- 3+:1- 4+:0-сумма442036171310502743202020565258112122000000000000fIID (сМ)0,1000,2220,1160,1000,2500,4005,011,15,85,012,520,03.1.3.
Биохимические исследования ХОМ C. reinhardtiiСпектры поглощения in vivo культур хлорофильных оранжевых мутантовдемонстрировали сниженное по сравнению со штаммом дикого типа содержаниеХЛ и наличие в них пигмента протопорфириновой природы. Для установления ихпигментного состава был осуществлен качественный и количественный анализпорфиринов из клеток ХОМ. Накапливающие протопорфирин IX мутанты brs-1 иbrc-1,описанныеЭндиВангом[Wangetal.,1974],порезультатамгибридологического анализа оказались аллельными мутантам по генам CHL1 иLTS3 из ПГК (см.
подраздел 3.1.2.). Для подтверждения результатов тестов нааллелизм требовалось сравнить составы порфиринов в клетках «американских» и«русских» мутантов.3.1.3.1. Анализ пигментного состава клеток ХОМ C. reinhardtiiКачественныйиколичественныйсоставпигментовопределялисиспользованием методов абсорбционной спектроскопии, анализа флуоресценцииибумажнойхроматографии.Нарисунке3.5представленыспектрыфлуоресценции фракций различных порфиринов (уро- копро- и протопорфирина156IX), выделенных из клеток мутанта Н-19. При возбуждении флуоресценциидлиной волны =405 нм не наблюдалось свечения фракции уропорфирина между550 нм и 700 нм (линия 1), однако видна отчетливая флуоресценция фракциикопропорфирина с максимумами при 601 нм и 656 нм (линия 2).Рисунок 3.5.
Спектры флуоресценции (λвозб = 405 нм) солянокислых растворовфракций порфиринов, выделенных из мутанта Н-19 (генотипа chl1)хламидомонады. 1 – фракция уропорфириногена (УП) в 0,5N растворе HCl; 2 –фракция копропорфириногена (КП) в 0,1N растворе HCl; 3 – фракция протопорфиринаIX (ПП) в 1,5N растворе HClСтандартный копропорфирин в 0,1 N растворе соляной кислоты имеет другиеположения полос свечения – 697 нм и 654 нм. Во фракции протопорфирина IXфлуоресценция наблюдалась при 607 нм и 664 нм (линия 3), что соответствуетмаксимумам флуоресценции стандартного протопорфирина IX в 0,5 N раствореHCl. Хроматографическая идентификация пигмента, содержащегося во фракциикопропорфирина, показала, что он имеет подвижность, сходную с подвижностьюстандартного ПП, а не КП (рисунок 3.6).157Рисунок 3.6.
Бумажная хроматография порфиринов из мутантов по генуCHL1 C. reinhardtii: 1 – фракция протопорфирина IX; 2 – копропорфирина IX;3 – стандартный протопорфирин IX; 4 – стандартный копропорфирин IXПринимая во внимание флуоресцентные свойства этого порфирина(рисунок 3.5), а также его хроматографическую подвижность, можно утверждать,что пигмент, флуоресценция которого регистрируется во фракции КП, являетсяпродуктом деградации ПП. На рисунке 3.6 также видно, что порфирин фракцииППимеетхроматографическуюподвижность,аналогичнуюподвижностистандартного ПП.
Положения максимумов в спектре поглощения этого пигмента(рисунок 3.7) в диэтиловом эфире (407, 503, 536, 577 и 634 нм) соответствуюттаковым в спектре поглощения стандартного ПП [Rebeiz et al., 1970]. Такимобразом, качественный анализ порфиринов у мутанта по гену CHL1 показал, чтоиз безметальных порфиринов, в его клетках накапливается только один –протопорфирин IX.Результаты количественного анализа ПП и его магниевых производных:Mg-ПП и его монометилового эфира (МПЭ), протохлорофиллида (ПХЛД),хлорофиллида «а» (ХЛДа) и хлорофиллов (ХЛа и ХЛb) в клетках исследуемыхмутантов, представлены в таблице 3.17. Только в диком типе, содержащем158Рисунок 3.7.
Спектр поглощения протопорфирина IX (вдиэтиловом эфире). Пигмент экстрагирован из мутанта C. reinhardtiiH-19 генотипа: chl1 (1,2); 3. – стандартный ППмаксимальные количества ХЛ, по спектрам флуоресценции отмечено присутствиереальных количеств его поздних предшественников – ПХЛД и ХЛД. В мутантах,как правило, или вообще не удается их обнаружить, либо они присутствуют вследовых количествах. В отличие от штамма дикого типа, исследуемыехлорофильные оранжевые мутанты накапливают значительные количества ПП.При этом, сегреганты, несущие аллельные мутации по гену CHL1: chl1-19, or2/5,or5 и brs-1, достоверно не различаются между собой по количественномусодержанию ПП (Р 0,95) иуровень накопления ПП стабилен в потомстве(таблица 3.17).
Хотя мутация or3 обусловливает несколько сниженный уровеньПП, существенно не различаются между собой по количественному показателю имутанты по гену LTS3 (штаммы, несущие мутации: or13, lts3-122 и brc-1). Нарядус отсутствием четко выраженных различийв накоплении ПП у аллельныхмутантов, обнаружились различия по содержанию пигментов между мутантами,принадлежащими разным группам комплементации. В клетках мутантов по генуCHL1, практически нет ХЛ и его магниевых производных (от МПЭ до ХЛ), тогда159как у мутантов по гену LTS3 они обнаружены в следовых количествах.
На светумутанты по гену CHL1 гибнут, тогда, как lts3-штаммы ˗ зеленеют.Таблица 3.17. Содержание протопорфирина IX и его магниевых производныху штамма дикого типа и ХОМ C. reinhardtii, выращенных в темнотеШтаммГенотип137C1482-2e1514-7в1517-1brs-1Д-2/5-16brc-11430-23а1419-1в1423-25аwtchl1-19chl1-19chl1-19brs-1or2/5brc-1or3or13lts3-122Содержание пигментов (Моль x 109 клеток)*ППМПЭПХЛДХЛДХЛн.о.н.о.0,0170,0343,4570,191н.о.н.о.н.о.н.о.0,154н.о.н.о.н.о.н.о.0,162н.о.н.о.н.о.н.о.0,150н.о.н.о.н.о.н.о.0,182н.о.н.о.0,0070,124н.о.н.о.0,0960,131н.о.н.о.0.0420,0930,0010,0010,0010,2170,1010,0020,0010,0010,123* - Примечание: измерения проводились в 3-5 повторностях, во всех случаях ошибкисоставляют не более 2-3%.
В таблице пигменты обозначены следующим образом:ПП – протопорфирин IX; МПЭ - протопорфирина IX монометилового эфир;ПХД – протохлорофиллид; ХД - хлорофиллида «а»; ХЛ - хлорофиллы «а» и «б»;н.о. – не обнаружено.Экспериментальная работа по определению пигментного состава клетокмутантов по генам CHL1 и LTS3 была продолжена на базе двух немецких научныхцентров: в лаборатории проф. Рюдигера (W.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
