Диссертация (1144823), страница 29
Текст из файла (страница 29)
Rudiger, Botanisches Institut, LudwigsMaximilian-Universitat, Munich), и в лаборатории проф. Гримма (B. Grimm, Institutfur Pflanzengenetik und Кulturpflanzenforschung, Gatersleben). Содержание ХЛ и ихпредшественников определяли методами абсорбционной спектроскопии ижидкостной хроматографии (HPLC). Финальные результаты этих исследованийпредставлены в таблице 3.18.160Таблица 3.18. Содержание хлорофилла и его предшественников в клеткахмутантов, неспособных синтезировать хлорофилл в темноте*Штамм УсловияростакультурCC124светLts3светBrc1светy-7светCC124темнотаLts3темнотаBrc1темнотаy-7темнотаЛ-7темнота1482-2e темнотаbrs-1темнотаГенотип Содержание пигментов (nMol/109 клеток)ППwtlts3brc1y-7wtlts3brc1y-7y-7, pc-1chl1brs-1Mg-ПП МПЭ ПХЛД0,190,410,370,20,312,014,00,430,8130,050,00,200,540,670,200,770,540,180,560,390,080,620,82нннннннннн0,817,042,036ннХЛДн89-529*54-385*ннннннХЛГем5000 232400270042002450 47180 94240 8254ннн270н210* - Условные обозначения: ПП – протопорфирин IX; Mg-ПП – магний протопорфирин IX;МПЭ – монометиловый эфир Mg-ПП; ПХЛД – протохлорофиллид; ХЛД – хлорофиллид; ХЛ –хлорофиллы (a+b); н.
– наличие пигмента не регистрируется; В таблице даны средние значения5-7-повторностей измерений. Во всех случаях ошибка не превышает 5%;* - содержание пигмента измеряли в условиях переноса культуры из темноты на свет, так какпри постоянном освещении протохлорофиллид не накапливается.3.1.3.2. Активности ферментов биосинтеза хлорофилла у ХОМ C. reinhardtiiРезультаты анализа активности трех ферментов ранних этапов биосинтезаХЛ: магний-хелатазы (МХ), магний-протопорфирин IX-метилтрансферазы иАЛК–синтезирующегокомплекса,представленныевтаблице3.19,свидетельствуют, что у chl1-мутанта резко снижена активность только одного изних – МХ. Эти данные, наряду со способностью мутантов по гену CHL1накапливать субстрат этого фермента ˗ ПП, с высокой долей вероятностипозволяли предполагать, что продуктом гена CHL1 является одна из субъединицмагний-хелатазы.
В световой культуре мутанта по гену LTS3 активность двух161сопряженно-функционирующих ферментов: МХ и Mg-ПП-метилтрансферазыимела промежуточноые значения между темновыми и световыми культурамиштамма дикого типа. Относительная активность АЛК-синтезирующего комплексау темновых культур снижена примерно на 40% от уровня растущих на светуклеток.Таблица 3.19. Активность ферментов биосинтеза хлорофилла у мутантовхламидомонады по генам CHL1 и LTS3Штамм,условиякультивированияCC124 (свет)1500-1а (свет)CC124 (темн.)1482-2е (темн.)ГенотипАктивность ферментов:Mg-хелатазыMg-ПП-метил(fkat/g )трансфераза (kat/g)1443,51073,2902,72,72,7wtlts3wtchl1АЛК(% )100916063У высших растений и зеленых водорослей активность ферментовбиосинтезаХЛвнормеиндуцируетсясветом.ПродуктивностьАЛК-синтезирующего комплекса на свету обычно на 40 - 50% ыше, чем в темноте, ипоскольку количество субстрата - АЛК на свету в клетке увеличивается,ферменты, осуществляющие дальнейшее превращение АЛК до ХЛ начинаютфункционировать на 20-40% эффективнее.
Более древним в эволюционномотношении является темновой синтез ХЛ. Если в клетках существует два путисинтеза хлорофилла: темновой и световой, то на долю каждого приходится 60% и40% активности, соответственно.3.1.3.3. Белковые компоненты магний-хелатазы у мутантов C.reinhardtii по генам CHL1 и LTS3Накопление протопорфирина IX клетками мутантов по генам CHL1 и LTS3указывало, что биосинтез ХЛ у них нарушен на этапе превращения ПП в Mg-ПП.Встраивание магния в молекулу ПП осуществляет фермент магний-хелатаза162(МХ), который у всех, изученных к настоящему времени организмов,представляет собой белковый комплекс, состоящий из трех субъединиц: большой(H), средней (D) и малой (I). К моменту начала экспериментов, мы располагалиантителами к субъединицам H и I МХ табака и арабидопсиса.
Эти антитела ибыли использованы для Western-blot анализа белков, экстрагированных из клетокдикого типа и ХОМ C. reinhardtii. Применетие гетерологичных антителзатрудняло иммунодетекцию искомых белков, однако нам удалось показатьналичие белков с ожидаемой молекулярной массой для субъединиц H и I МХ(рисунок 3.8) в экстрактах штамма дикого типа C. reinhardtii и мутанта по генуLTS3.Рисунок 3.8. Вестерн-блот анализ белков из клеток мутантов по генам CHL1(генотипа: chl1, brs-1, or2/5), LTS3 (генотипа: lts3, brc-1) и штамма дикоготипа (wt). Иммуноблотинг с антителами к субъединицам H и I МХ арабидопсисаСреди белков, выделенных из мутантов по гену CHL1 не удалостьобнаружить субъединицу H магний-хелатазы. Хотя качество «картинок»,полученных в эксперименте, далеко от идеала, они однозначно указывали наотсутствие в chl1-мутантах белка большой субъединицы (H) магний-хелатазы.3.1.4. Обсуждение результатовГенетические исследования процессов биосинтеза хлорофилла (ХЛ)начались с создания коллекций пигментных мутантов фотосинтезирующихорганизмов: цианобактерий, водорослей и высших растений.
В этой областинауки пионерскими стали работы Самуэля Граника, который первым изолировалбесхлорофильныймутантзеленойводорослихлореллы,накапливавший163протопорфирин IX (ПП) – соединение, тогда известное как предшественникжелезосодержащего порфирина гема [Granick, 1948а]. Основываясь на изученииэтого мутанта и мутанта, накапливающего магний-ПП [Granick, 1948b], онпредложил схему общего пути биосинтеза порфиринов из 5-аминолевулиновойкислоты (АЛК), где магний, встраиваясь в ПП, образует Mg-ПП, которыйпревращается в протохлорофиллид (ПХЛД) и, далее, в ХЛ [Granick, 1950].Биохимические и физиологические исследования бесхлорофильных мутантовхлореллыдалиобширнуюинформациюометаболизмеХЛиегопредшественников, но генетическая регуляция этих процессов оставаласьнеизвестной, поскольку гибридологический анализ у хлореллы невозможен.Первые данные о генетическом контроле процессов хлорофиллобразованияпоявились при изучении мутантов зеленой водоросли С.
reinhardtii и ячменя. В1955 году Р. Сэджер описала индуцированный УФ-излучением коричневыйсветочувствительныймутантbrхламидомонады,накапливающийпредшественники ХЛ. Описанная мутация была рецессивна, наследоваласьмоногенно (2+ : 2-) и была локализована в 17 сМ от центромеры [Sager, 1955].
Вначале 60-х годов XX века пигментный состав мутантов ячменя с нарушениямисинтеза ХЛ начал исследовать Дитер Веттштейн [von Wettstein, 1959]. Используяабсорбционную и флуоресцентную спектрофотометрию, он показал отсутствиепротохлорофиллида (ПХЛД) и ХЛ у желтых мутантов, названных xantha-f, ипредположил, что у них генетический блокнаходится между ПП и ПХЛД.Только 38 лет спустя ему и его ученикам удалось показать, что Xantha-f кодируетбольшуюсубъединицумагнийхелатазы–фермента,встраивание магния в молекулу ПП [Jensen et al., 1996].генетическиеибиохимическиеисследованияосуществляющегоИнтенсивныебесхлорофильныхмутантовначалось в конце 60-х – начале 70-х годов. Почти одновременно появляютсяработы о мутантах ячменя [von Wettstein et al., 1971, 1974] и хламидомонады[Столбова, 1971; Wang et al., 1974].
Генетико-биохимические исследования164бесхлорофилльных, накапливающих ПП, мутантов C. reinhardtii, описаны в этомразделе 3.1 настоящей работы.Петергофская генетическая коллекция штаммов зеленых водорослей[Квитко с соавт., 1983] была создана около 40 лет назад на кафедре генетики иселекции ЛГУ, По мере ее пополнения, возникла необходимость системногоисследования групп фенотипически-сходных мутантов хламидомонады. Задачейавтора стало изучение хлорофильных оранжевых мутантов (ХОМ).
Клетки ХОМне синтезируют ХЛ и в гетеротрофных условиях накапливают бурый пигментпорфириновой природы, придающий их колониям желто-оранжевую окраску.ХОМ, вместе с полученными в США штаммами brs-1 и brc-1 сходного фенотипа[Wang et al., 1974, 1978], были вовлечены в гибридологический анализ длявыяснения их генетической природы. Менделевский характер наследованиямутантных аллелей свидетельствовал о том, что они являются единичнымимутациями в ядерных генах.Спектрофотометрия нативных культур ХОМ показала наличие в их клеткахпигмента с максимумом поглощения в области 540 нм, характерным дляпротопорфиринов. По содержанию ХЛ мутанты можно было разделить на двегруппы.
Для штаммов генотипа: chl1-19, or2/5 и or3 характерно полное ихотсутствие, тогда как другие формы оказались способны зеленеть на свету.Аллельныевзаимоотношенияядерныхмутаций,обусловливающихблокирование биосинтеза ХЛ и накопление порфириновых пигментов у C.reinhardtii, изучали, используя комплементационный и рекомбинационный тесты.Для анализа комплементации в группе фенотипически-сходных ХОМ был выбранметод микроспектрофотометрии молодых гамет и зигот, позволяющий получатьспектральные характеристики индивидуальных клеток, по которым оценивалиуровень содержания в них пигментов (прежде всего ХЛ).
Спектры поглощениязигот, полученных при скрещивании ХОМ между собой, снимали, используямикроспектрофотометр МУФ5. Оценка содержания хлорофиллов (К=Е440/Е560)в зигоспорах дикого типа и зигоспорах с различными сочетаниями мутаций165бесхлорофильности, их гомо- и гетерозигот, показала, что все изучаемые ядерныемутации рецессивны и распределены по двум группам комплементации:группа I, куда входят мутации: lts3-122, or13 и or69;группа II, обьединяющая мутации: chl1-19, or3, lts7 и or2/5.Таким образом, нарушения биосинтеза ХЛ, приводящие к накоплениюпорфиринов у ХОМ, оказались обусловлены мутациями в двух ядерныхгенетическихлокусах,названныхLTS3иCHL1.Микроспектрометрияподтвердила ранее выявленные фенотипические различия мутантов по этим генам– chl1-мутантыне содержат ХЛ, тогда как мутации в гене LTS3 ведут кнакоплению некоторого его количества.Бесхлорофильные мутанты Э.
Ванга, накапливающие протопорфирин IX[Wang et al., 1974], также были вовлечены в исследования. Для анализакомплементации мутаций brc-1 и brs-1 с мутациями в генах CHL1 и LTS3использовали микроспектрофотометр SMS-03 фирмы Opton, который в отличиеот МУФ-5 обладает хорошим разрешением в красной области спектра, ипозволяет регистрировать оптическую плотность в максимумах поглощения ХЛаи ХЛb – 680 нм и 650 нм, соответственно. Результаты экспериментовсвидетельствовали об аллельности мутаций brs-1 и chl1, а также brc-1 и lts3.
Вклеткахдиплоидов,гетерозиготныхпоэтиммутациям,полностьювосстанавливается фенотип дикого типа, а у дигетерозигот генотипа: brs-1/+,+/lts3 восстанавливался синтез ХЛа при более низком (по сравнению с зиготамидикого типа) относительном содержании ХЛb. Снижение уровня ХЛb могло бытьсвязано с нарушением экспрессии генов для хлорофилл а/б–связывающихполипептидов, описанное для мутантов brs-1 и brc-1 [Johanningmeier, 1984]. Присохранении нормальной структуры хлоропласта одного из родителей, наличие ППне препятствует нормальному биогенезу хлоропласта в гетерозиготе, и, повидимому, регуляция экспрессии ядерных генов, контролирующих синтез ХЛ ухламидомонады, происходит по-разному в уже сформированных хлоропластах ив новообразующихся хлоропластных мембранах.166Рекомбинационныетесты,проведенныеметодомпосемейственногоанализа, показали, что аллельные мутации, принадлежащие к разным группамкомплементации, рекомбинируют свободно, то есть, не сцеплены между собой.Хотя объемы выборок потомства анализируемых зигот не позволяют говорить овнутригеннойрекомбинации,ониподтверждаютрезультатыкомплементационного теста.Для выяснения генетической природы анализируемых мутаций былпроведен гибридологический анализ мутантов C.
reinhardtii по генам CHL1 иLTS3. Низкая фертильность ХОМ и высокая летальность зооспор в потомствезигот с их участием, затрудняли тетрадный анализ – основной методидентификации и картирования мутаций. В связи с этим, были созданыфертильные мутантные штаммы и использованы все возможные методыгенетического анализа, включая посемейственный анализ, случайную выборкузооспор, учет расщепления трисомиков (++-) и митотическую рекомбинациюгетерозиготных диплоидов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
