Диссертация (1144823), страница 26
Текст из файла (страница 26)
В случае ХОМ, высокая летальность, преимущественнаягибель двойных рекомбинантов и ряд других причин затрудняют получениештаммов, объединяющих мутации «оранжевости» и мутантные аллели генаARG7. Поэтому, для изучения комплементации в группе хлорофильных141Таблица 3.3. Рекомбинанты ХОМ, полученные в работеШифрГенотипПроисхождение (родители)mt+mt-штамма784-3mt+, chl1-19301-4aN-19762-6mt+, chl1-19301-4aN-191482-2еmt+, chl1-19См. рис. 3.11496-1аmt+, chl1-191482-2eCC13361419-1вmt-, or13Nic-11Sr-2-60/131435-1аmt-, or131429-13a1429-13c1481-7бmt-, or13CC781419-1d1486-3вmt-, or131481-7b4941416-4mt-, lts3-122Arg2N1221423-25аmt+, lts3-1222771416-4Д-2/5-16mt+, or2/5T-5-52гD-21439-14аmt+, or2/5D-2/5-161430-25a*1439-8гmt-, or2/51480-3бmt-, or69301-4a494/691480-5вmt+, or69-―-―1430-20бmt-, or3430494/31430-23аmt+, or3-―-―Д-19-14mt-/+, arg7-8/arg7/8, chl1-19/chl1/19T-5-52гD-19/2-201510-3вmt+, or5Ас-20-5Sr-2-60* - аналог штамма 430 (см. табл. в «Материалы и методы»)Таблица 3.4.Тетрадный анализ скрещиваний ХОМ на штаммы дикого типаШифрскрещиванияС1436С1496С1430С1438С1439С1429С1425С1426С1509С1510Родители:ГенотипЧисло тетрад(2+ : 2-)ХОМДикий тип мутанта782-6430mt-, chl1-19451482-2еСС-1336mt+, chl1-1936494/3430mt-, or3461430-20бArg-7mt+, or310Д-2/5-161430-25аmt+, or2/5151419-1в430mt-, or13321416-4277mt+, lts3-1227494/69Nrmt-, or697НГ-2Nrmt-, lts712Ас-20-5Sr-2-60mt+, or56142оранжевых мутантов был использован иной метод – микроспектрофотометрияотдельных клеток молодых зигот и гамет, разработанный П.
Бояджиевым и К.В.Квитко [Бояджиев с соавт, 1973]. Этот метод обладает высокой эффективностьюпри работе с живыми клетками, так как позволяет получить контрастнуюхарактеристику отдельного фенотипа – хлоропласта. Комплементацию мутаций,нарушающих процессы фотосинтеза у хламидомонады можно изучать прямо намолодых зиготах в силу следующих причин:а). Молодые (двух-трехдневные) зиготы заведомо диплоидны, так как мейозможно индуцировать только после 4-10-дневного периода покоя [Bernoun et al.,1980];б). Молодые зиготы всегда содержат одно ядро и один хлоропласт, несущиегенетическую информацию от обоих родителей [Cavalier-Smith, 1976];в) Фотосинтетические мутанты имеют характерный спектр поглощения как всуспензии, так и в одиночных клетках, что позволяет использовать ихспектральные характеристики как фенотипический признак.СпектрыпоглощенияХОМявляютсяихчеткойфенотипическойхарактеристикой, поэтому изучение комплементации мутаций «оранжевости»методом спектрофотометрирования явилось оптимальным и обоснованнымвыбором.Хлорофильные оранжевые мутанты, исследованные нами, имеют свойхарактерный спектр поглощения как в суспензии, так и в одиночных клетках.
Нарисунке 3.3 представлены спектры отдельных молодых зигот дикого типа игетерозигот по мутациям «оранжевости». Для мутантных гамет и гомозиготхарактерно сильное уменьшение (по сравнению с диким типом) поглощениявеличины оптической плотности в полосе 440 нм, соответствующего поглощениюхлорофилла а in vivo.Для количественной оценки содержания хлорофиллов (ХЛ) у зигоспор сразличными сочетаниями хлорофильных мутаций, их гомо- и гетерозигот, былаиспользована величина К=Е440/Е650, где значения экстинции, характеризующие143АБВРиунок 3.3. Микроспектрофотометрия(микроспектрофотометр МУФ5)ГотдельныхзиготC.reinhardtiiнакопление хлорофилла (Е440) отнесено к Е650, которая служит меройсветорассеяния (таблица 3.5). У зигоспор дикого типа и гетерозигот по мутациям«оранжевости» численные значения величины К составляют 8,7 и выше, тогда каку мутантных гамет и гомозигот– не превышает 3.
Величины К для гомо игетерозигот достоверно различаются (Р 0,005). Восстановление фенотипадикого типа у гетерозигот позволило сделать вывод о рецессивности изучаемыхмутаций. По итогам комплементационного теста все проверенные мутациираспределились по двум группам комплементации:Таблица 3.5. Комплементация мутаций бесхлорофильностиГенотипзигот:or13or13lts3-122or69chl1-19or3or2/5lts7wtОтносительное поглощение света хлорофиллом (К=Е440/Е560)индивидуальных гамет и зигот3,00,36lts3-1222,90,232,10,68or693,10,382,80,742,80,91chl1-198,91,419,01,849,01,441,10,03or38,91,219,91,649,01,311,30,021,70,02Or2/59,32,449,11,839,11,541,10,061,80,721,10,48lts78,88,88,81,11,71,1н.о.wt8,71,198,82,118,81,738,90,519,32,189,91,358,71,548,72,31гаметы2,30,112,00,112,20,541,10,211,70,411,20,421,20,977,40,61144Группа I, куда вошли мутации lts3-122, or13 и or69.Группа II, обьединяющая мутации: chl1-19, or3, lts7 и or2/5.Представители каждой из групп различаются фенотипически.
Так, штаммы,несущие некомплементирующие мутации lts3-122, or13 и or69, способнынакапливать некоторое количество хлорофилла (К=2,6), тогда как мутанты издругой группы его практически не имеют (К= 1,4).В дальнейшем, удалось вовлечь в анализ бесхлорофильные, накапливающиепротопорфирин IX мутанты: brs-1 и brc-1, полученный в США [Wang et al., 1974].Комплементацию этих мутаций изучали с помощью микроспектрофотометраSMS-03 фирмы ―Opton‖ с системой обработки данных ‗IBAS‖, обладающегохорошей разрешающей способностью в длинноволновой части спектра. Онпозволяет регистрировать оптическую плотность ХЛ в максимумах поглощения:ХЛа - 680 нм, и ХЛb - 650 нм.
Уровень накопления ХЛа у гомо- и гетерозиготопределяли по величине соотношения Е680/Е650 (рисунок 3.4), которая у зигоспорАБРисунок 3.4. А - Содержание ХЛа (Е680/Е560) и Б соотношения ХЛа/Хлb (Е650/Е560)/(Е650/Е560) взигоспораххламидомонады.Мутацияcbn-1приводит к отсутствию ХЛb145дикого типа оказалась близка к 2, у зигоспор генотипа: сhl1/chl1 и lts3/lts3 изизоаллельных скрещиваний - около 1.
Зигоспоры генотипов: brs-1/chl1 и brc-1/lts3достоверно не отличаются по этому показателю от изоаллельных вариантов. Вгетерозиготах генотипов: chl1/+, brs-1/+,lrs3/+ иbrc-1/+ полностьювосстанавливается фенотип дикого типа. В зигоспорах, полученных отскрещивания мутантов brs-1 и lts3, полностью восстанавливается уровень ХЛа(К=1,84).Этоттестпоказал,чтомутацияbrc-1принадлежитгруппекомплементации I, объединяющей мутации lts3-122, or13 и or69, а мутация brs-1аллельна мутациям из группы комплементации II - chl1-19, or3, lts7 и or2/5.3.1.2.3.
Изучение рекомбинации мутантных аллелей в группе ХОМДляуточнениярезультатовкомплементационноготестаизучалирекомбинацию мутантных аллелей методом посемейственного анализа гибридныхзигот (таблица 3.6), и показали, что для мутаций: chl1-19, or13, or5 и lts7 частотапоявления зеленых рекомбинантов (R) в потомстве двух «оранжевых» штаммовменьше величины 3,9 x 10-4.
Одна секторная колония, обнаруженная в потомствеС1450, может быть результатом либо реверсии одного из родительских штаммов,или внутригенной рекомбинации аллелей: or2/5 и chl1-19. Мутации второйгруппы комплементации: lts3-122, or13 и or69 не рекомбинировали. В потомствезигот, объединяющих мутации разных групп комплементации, наблюдалисвободную рекомбинацию анализируемых маркеров.В тетрадах мейотического потомства скрещивания С1451 выживаемостьзигот составила 98%, а летальность зооспор ˗ менее 5%.
Такие высокиепоказатели выживаемости позволили наиболее полно использовать данныесемейного анализа потомства этого скрещивания для оценки рекомбинациимаркеров or2/5 и or13 (таблица 3.7), принадлежащих к разным группамсцепления. В этом случае, оранжевые колонии можно интерпретировать какклоны, образованные тетрадой родительского дитипа (PD), а секторные колониипоявляются только в результате рекомбинации. Зеленые колонии могут быть146диплоидами, неполным потомством неродительских дитипов (ND) и тетратипов(Т), или результатом аномального мейоза. Наблюдаемые соотношение оранжевыхТаблица 3.6. Посемейственный анализ потомства зигот скрещиванийоранжевых хлорофильных мутантов С.
reinhardtiiШифрРодители:гибрида mt+mt-Генотип зигот Sz (%)* Число колонийфенотипа:орзел ор/зел б.к всегоС1442C1528C1443С1441C1445C1450C1498C1499C1446C1447C1449C1451C1452C1493C1494C1492C1453C1454C1502chl1-19/chl1-19chl1-19/chl1-19chl1-19/or3chl1-19/or3or3/chl1-19or2/5/chl1-19chl1-19/lts7or5/chl1-19chl1-19/or13or3/or13lts3-122/or3or2/5/or13lts3-122/chl1-19brs1/or13brc1/or13brs1/chl1-19lts3-122/or13or69/or13or5/or13784-31482-2e784-3784-31430-23aД-2/5-161482-2eAc-20-5784-31430-23а1425-23Д-2/5-161425-23Brs-1Brc-1Brs-11425-231470-5aAc20-5782-6Н-19-25494-31430-20б782-6782-6НГ-21519-19в1419-1в1419-1в494/31419-1в782-61481-1в1481-1в1496-1a1419-1в1419-1в1419-1в0,485,140,110,0419,318,70,540,784,8432,40,0168,90,050,010,030.060,210,030,96680852013684007663843956896224061480229781716682813191938494314000000004411122159502580000540000010010151011592431000060000741630000000000000680852013684008405473956896229432370119831024606682813191938494374R** 1,1∙ 10-4 3,8∙10-4 1,2∙10-31,8% 2,5∙10-4 1,1∙10-418,4%81%31,5%88,4%23,5%43,5% 1,5∙10-4 1,2∙10-4 1,1∙10-4 1,2∙10-416%*- выживаемость зигот;** - частота появления зеленых рекомбинантов; б.к.
– белые колонии.и зеленых колоний (таблица 3.7) соответствуют теоретически-ожидаемым присвободной рекомбинации (1PD:1ND:4T) для выборки заведомо гаплоидныхпотомков, а при учете всей совокупности виден дефицит рецессивов,естественныйпринизкойвыживаемостимутантныхспор.Свободнаярекомбинация мутаций or2/5 и or13 - результат отсутствия их генетическогосцепления.Такимобразом,мутации,принадлежащиеразнымгруппамкомплементации, рекомбинируют свободно, то есть, не сцеплены между собой.147Таблица 3.7.Анализ потомства зигот (генотипа: or2/5/or13) скрещиванияС1451Тетрадный анализТип тетрад4 оранж. : 0 зел.2 оранж. : 2 зел.3 оранж. : 1 зел.4 зел.
: 0 оранж.всегоЧислотетрад124310Семейный анализ (число колоний)наблюдаемое Теоретически ожидаемое при 1PD:1ND:4T****2**22292310,0233037,081159115716535951983013881983* - выборка без учета зеленых колоний;** - вся выборка.Менделевское расщепление по локусу типа спаривания (2mt+ : 2mt-) втетрадах, где все зооспоры имели зеленую окраску, свидетельствовало, что такие«зеленые» тетрады (в семейном анализе - это зеленые колонии) не результатдиплоидии (в этом случае все потомство должно иметь тип спаривания mt-), апотомство зигот, прошедших мейоз. Причиной однообразия спор по пигментациимогло стать нерасхождение хромосом с этими локусами. В потомстве С1451зеленые колонии появлялись с частотой ок.
30% , и для выяснения их генотиповбыли поставлены дополнительные эксперименты (подраздел 3.1.2.5).3.1.2.4. Тетрадный анализ мутантов по генам CHL1 и LTS3 C. reinhardtiiТесты на аллелизм показали, что фенотип изучаемых хлорофильныхоранжевых мутантов хламидомонады обусловлен мутациями в двух ядерныхгенах CHL1 и LTS3. Следующая задача, которую следовало решить, состояла в ихкартировании.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
