Диссертация (1144823), страница 22
Текст из файла (страница 22)
В последние годы удалосьобнаружить значительное количество факторов, участвующих в этих процессах,однако в области генетики регуляции биосинтеза хлорофиллов осталосьмноготайн, раскрытие которых еще предстоит.1182. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ2.1. Генетический материалВ работе использованы штаммы Chlamidomonas (C.) reinhardtii изПетергофской Генетической Коллекции (ПГК) [Квитко и др., 1983] и изколлекцииЦентраГенетикиХламидомонады(CGC)[Harris,1989],поддерживаемые на кафедре генетики СПбГУ.
Их краткая характеристикапредставлена в таблице 2.1. Описания рекомбинантов, гаплоидных и диплоидныхштаммов, полученных и использованных в работе, даны в ходе изложенияэкспериментального материала.2.2. Условия культивирования штаммов хламидомонадыДля поддержания культур клеток C. reinhardtii использовали стандартныепитательные среды [Квитко, 1975], состав которых представлен в таблице 2.2.Культуры выращивали при температуре 20-25 °С на белом свету (200 - 300µE/м2сек), а светочувствительные штаммы – в темноте.
Контроль генетическихмаркеров осуществляли, используя селективные среды. Они содержали: аргинин –50 мг/л, никотинамид – 0,75 мг/л, стрептомицин – 5-50 мг/л, актидион(циклогексимид) – 2,5 мг/л, метионинсульфоксиимин – 300 мг/л, эритромицин –50-200 мг/л. Тиаминзависимость определяли как чувствительность к егоантиметаболиту – окситиамину (1 мг/л). Тестирование признаков ауксотрофностии устойчивости проводили методом отпечатков на серию сред [Захаров, Квитко,1967].2.3. Тестирование признака – парализованные жгутикиКлетки C.
reinhardtii суспензировали в воде, помещали на свет, и через 2 часаэтот признак можно было выявлять по оседанию на дно пробирки клеток спарализованными жгутиками, тогда как клетки дикого типа плавали в толще119воды. Нарушение подвижности и дефекты жгутикого аппарата также наблюдали спомощью оптического микроскопа (окуляр 20х, объектив 10х).Таблица 2.1. Штаммы хламидомонады, использованные в работеШтамм1494СС-124137С(+)СР-2-60НРНик-11Фенотип2Зеленый прототрофЗеленый прототрофЗеленый прототрофЗеленый стрептомицинустойчивыйзеленыйнеоминустойчивыйЗеленыйникотинамид-зависимый277430СС-1336СС-78Арг7Арг211-32фД-2Т-5-52гЗеленыймножественномаркированный– // –ЗеленыйэритромицинустойчивыйЗеленый аргининзависимый– // –– // –Генотип3mtmtmt+mt-,sr-u-2mt+, nr-u-2-1Происхождение4Колл.
Р. Смита (США)Колл. Р. Левина (США)Колл. Р. Левина (США)Колл. Н. Гилхема(США)– // –Колл. М. Адамса(США)mt+, nic7Колл. Эберсольда(США)mt+, ac-17, nic-13, pf- Колл. Н. Гилхема2, pir-1, can-1, msr- (США)1,act-2mt-, pf-14,act-2CGCmt-, ery3– // –mt+, nic-11mt-, arg7mt-, arg7-8mt+, arg7-8Зеленый прототроф mt+/mt-, arg7/arg7-8Зеленый аргинин- mt+/mt-, arg7/arg7-8зависимыйД-19/2-20Зеленый прототроф mt+/mt-, chl1-19/+,arg7/arg7-8Н-19Оранжевыйmt-, chl1светочувствительныйН-122– // –mt-, lts3НГ-2– // –mt-, lts7СР-2-60/13– // –mt-, or13494/3– // –mt-, or3494/69– // –mt-, or69brs-1– // –mt+, brs-1brc-1– // –mt+, brc-1АС-20-5– // –mt+, ac-20ПГК – Петергофская генетическа коллекцияКолл.
Н. Гилхема(США)Колл. Э. Георга(Англия)ПГК (Карпова, 1982)ПГК (Чумакова, 1976)– // –ПГК (Столбова, 1971)– // –– // –ПГК (Бояджиев, 1974)– // –– // –От В. Т. Ванга(Wanget. al., 1974)ПГК120Таблица. 2.2. Состав сред, использованных в работеКомпонентыСоставTAPРастворБейеринка*ФосфатныйбуферTrisбуферАцетатнатрияРаствор микроэлементовНа 1л H2ONH4Cl16грMgSO44грCaCl22грНа 100мл H2OK2HPO49,36грKH2PO46,3грНа 1л H2OTris base24,2грHCl15млНа 1л H2OH3BO31грZnSO4…7H2O1грMnSO4…4H2O0,4грCoCl2…6H2O0,2грCuSO40,04грNa2MoO4…2H2O0,2грДрожжевойавтолизатАгар25 млна 1л средыTAP обог.Т25 мл25 мл1 мл1 мл1 мл100 мл100 мл100 мл2 гр2 гр-1 мл1 мл1 мл-0,4 гр-15 гр15 гр15 гр*Для приготовления безазотистой среды Т использовали раствор Бейеринка без NH4Cl2.
4. Гибридологический анализ мейотического потомстваПостановка скрещиваний. Скрещивания проводили по методу, описанномуА.В. Столбовой [Столбова, 1971]. Выросшие на агаре клетки родительских формсуспензировали в воде (или среде Т без азота) и культивировали 24 часа на светудляиндукциигаметогенеза.Суспензиигаметпротивоположныхтиповспаривания объединяли и выдерживали на свету в течение 2-х часов, а затемкопуляционную смесь выливали на чашки Петри с твердой (3% агар) средой ТAP.Эти чашки со смесью зигот и вегетативных клеток оставляли на свету на сутки, азатем помещали на 6 суток в темноту. За это время зиготы созревали и былиготовы к индукции мейоза.121Тетрадный анализ. Для индукции мейоза созревшие зигоспоры штрихомчерез середину чашки Петри переносили на среду, разлитую тонким слоем (2-3мм), и обрабатывали 25 секунд парами хлороформа, убивающими вегетативныеклетки.
Через 20-24 часа культивирования на свету зиготы прорастают, образуя 48 зооспор. Изоляцию зооспор индивидуальных зигот проводили на агаровыхпластинкахприпомощиоплавленнойиглы,сиспользованиеммикроманипулятора ММ-1 в сочетании с микроскопом МБС-1. После того, какмейотические продукты формировали колонии, тетрады нумеровали, описывали итестировали методом реплик на серию сред. При математической обработкерезультатов тетрадного анализа, расстояния между генами (Д) в сантиморганидах(сМ) в случае наличия их сцепления определяли по формуле:Д=(0,5fT+3fN)·100.Расстояние ген-центромер рассчитывали по формуле:Д=0,5fT·100,где fN и fT – частоты появления неродительских дитипов и тетратипов впотомстве анализируемых зигот [Захаров, 1978].Посемейственный анализ. Методика посемейственного анализа состоит впереносе смеси зигот и вегетативных клеток на свежую среду в расчете 300-700зигот на одну чашку Петри (концентрацию определяли в камере Горяева).
Послеэлиминации вегетативных клеток (парами хлороформа в течение 30 секунд) ииндукции мейоза светом (24 часа), зиготы прорастают. Продукты мейоза однойзиготы вырастают вместе и дают начало одной общей колонии.Случайная выборка зооспор. В отличие от посемейственного анализа, прислучайной выборке зооспор после обработки хлороформом смеси зигот ивегетативных клеток и индукции мейоза светом, содержимое «зиготическихмешков» равномерно распределяют шпателем по поверхности чашки Петри.Проросшие споры - потомство всех зигот, прошедших мейоз, и являютсяслучайной выборкой зооспор.1222.5. Определение типа спариванияТип спаривания клеток C. reinhardtii определяли, скрещивая исследуемыекультуры со штаммами-тестерами: СР-2-60 (mt-) и НР (mt+).
Наличие зиготрегистрировали по пленке, образуемой ими на поверхности суспензии скопуляционной смесью (полученной, как описано в подразделе 2.4) на свету втечение 24-28 часов. Для светочувствительных бесхлорофилльных штаммов,интенсивность света была ниже пороговой (50–100 µE/м2сек). В сомнительныхслучаях образование зигоспор регистрировали с помощью микроскопа.2.6.
Определение размеров клетокДля определения размеров клеток использовали культуры в линейной стадиироста. Препараты клеток C. reinhardtii, обездвиженных йодом и наносили на слойполужидкого (0,5%) агара. Измерения проводили на микроскопе NU2 (фирмыCARLZEISS, JENA) с проекционным экраном, на который предварительнонаводили шкалу объект-микрометра и устанавливали 1000-кратное увеличение (1мкм в 1 мм). Промеряли наибольший диаметр (Д) каждой клетки; просчитывалине менее 200 клеток каждого штамма. Средний объем (v) вычисляли по формуле:V (мкм3) = 1/6•Д•0,64,где 0,64 – поправочный коэффициент, учитывающий элипсоидную формуклеток [Чемерилова, 1979].2.7. Мутагены и методы мутагенезаХимический мутагенез. В работе использовали следующие химическиемутагены: N-метил-N-нитро-N-нитрогуанидин (МННГ, получен в лабораториихимического мутагенеза ИХФ АН СССР); 2-амино-6N-гидроксилампурин (АГАП)и диэпоксиоктан (ДЭО).
Оценку частоты ревертирования проводили в спот-тестепо методу Айера и Шибальского, внося вещества на дисках фильтровальнойбумаги в центр чашки Петри, куда предварительно высевали суспензии клеток вконцентрации107кл/мл.Дляучетаревертированияоранжевых123светочувствительных мутантов чашки после 4-х суток инкубирования в темнотепомещали на свет. В работе использовали следующие стандартные количествамутагенов, наносимых на чашки с культурой клеток: МННГ – 10 мкг; ДЭО – 1мкл; АГАП – 20 мкл 1% раствора.Облучение суспензий клеток хламидомонады УФ-лучами проводили,используя лампу ДВЗО-1 (5 дж/м2).Инсерционныйфланкирующиемутагенез.инсерцию,былиНуклеотидныеидентифицированыпоследовательности,методомLMS-PCR,предложенным Олафом Крузом (Olaf Kruse) c соавторами [Strauss et al., 2001].При использовании этого метода амплификация фрагмента ДНК, не содержащеголокус-специфичный сиквенс, супрессирована за счет образования похожих насковородки структур (panhandle) с ручками, образуемыми адаптерами.2.8.
Методы спектрофотометрииФенотип мутантов по пигментации описывли спектрофотометрически –регистрируя спектры поглощения водных суспензий клеток in vitro наспектрофотометре СФ-10. Микроспектрофотометрирование одиночных живыхклеток(гаметизигот)проводилипометодике,разработаннойдляхламидомонады [Бояджиев и др., 1973], с модификациями. Препараты готовилиследующим образом: на покровное стекло наносили суспензию клеток или пленкис зиготами, после чего это стекло помещали на тонкий слой полужидкого (0,5%)Дифко-агара, предварительно нанесенного на предметное стекло. При этомклетки довольно долго сохраняются в нативном состоянии. Спектральныехарактеристикииндивидуальныхклетокполучали,используямикроспектрофотометр МУФ-5. Микроспектрофотометрирование проводили ввидимой области спектра (400-700 нм).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
