Диссертация (1144823), страница 20
Текст из файла (страница 20)
В хлоропластах фотосинтезирующих эукариот АЛКобразуется из глутамата в три этапа. После его активации – присоединениятранспортной тРНКGLU, ферментом Glu-тРНК-синтетазой следует превращениеглутамил-tРНКGlu в глутамат-1-полуальдегид с освобождением tРНКGlu ферментомtРНКGlu-редуктазой(GluTR).Далеефермент–глутамат-1-полуальдегид-аминотрансфераза (GSA-AT) осуществляет транс-аминирование с образованиемАЛК [Beale, 1990]. Из всех молекул, участвующие в формировании АЛК, длярегуляции биосинтеза хлорофилла наиболее важны две: тРНК Glu и GluTR [Tanakaand Tanaka, 2007].Кодируемые хлоропластными генами тРНКGlu задействованы в синтезе АЛКи белков, и узнаются, по крайней мере, двумя ферментами: GluRS, GluTR ифактором элонгации EF-Tu.
Установлено, что эти тРНК выполняют такжефункции регулятора транскрипции в хлоропласте [Hanaoka et al., 2005]. Впроцессе индуцируемого светом синтеза тилакоидных мембран, тРНК Gluнепосредственно связываются с NEP, ингибируя ее активность, и позволяя PEPтранскрибировать гены БФ. В пластидах синтез белков и тетрапирролов,возможно, конкурируют за глутаминовую тРНК. По-видимому, этой молекулепринадлежит ключевая роль в координации обоих процессов, столь необходимойпри формировании пигмент-белковых комплексов.Фермент GluTR- важнейший элемент в регуляции синтеза хлорофиллов. Егоактивность in vitro ингибируется гемом и ПХЛД не аллостерически, а только вприсутствии фракции растворимых белков, то есть через регуляторные белки[Srivastava et al., 2005].
Экспрессию генов GluTR у растений и водорослейрегулируют свет, растительные гормоны и циркадные ритмы [Gagne and Guertin,1992; McCormac et al., 2001].Ранние этапы биосинтеза хлорофилла – фермент магний-хелатаза.Большинство известных мутантов с нарушениями в пути передачи сигналов изхлоропласта в ядро одновременно являются мутантами по биосинтезу хлорофилла.108Мутации gun2-4 и laf6, ведут к накоплению ПП или Mg-ПП и затрагивают гены,контролирующие работу магний-хелатазы (МХ). Ряд мутаций в гене CHLH,кодирующем большую субъединицу (H) этого фермента, обусловливаютфенотип: cch (P642L) и gun5 (A990L), - у арабидопсиса, иgun-brs-1 (3152insT)хламидомонады. Все эти факты позволяют предполагать участие МХ в передачеретроградных сигналов.В процессе зеленения свет активирует транскрипцию гена CHLH, также каки GUN4.
Изучение световой регуляции экспрессии этих генов у мутантов пофоторецепторам: phyA и phyB показало, что CHLH в комплексе с GUN4участвуют в передаче световых сигналов от фитохромов [Stephenson and Terry,2008].Фитогормон абсцизовая кислота (АБК) – антагонист гормонов роста ауксинов,гиберрилиновицитокининов,подавляетметаболизмфотосинтезирующей клетки и играет ключевую роль в адаптации растений кнеблагоприятным условиям внешней среды.
Поиски рецепторов АБК привели квыделению белка арабидопсиса, названного ABAR (abscisic acid receptor). Поаминокислотнойпоследовательностибылапрочитанануклеотиднаяпоследовательность кодирующего его гена, который оказался геном CHLH большой субъединицы МХ [Shen et al., 2006]. Способность C-концевогофрагмента белка CHLH специфически связываться с АБК была подтверждена и вэкспериментах in vitro [Shen et.
al., 2006]. При этом, результаты, полученные наарабидопсисе, не нашли подтверждение при анализе белка CHLH ячменя [Mullerand Hansson, 2009] и, следовательно, вопрос о прямом участии CHLH вгормональной регуляции АБК остается дискуссионным. На сегодняшний деньустановлено, что H субъединица МХ, будучи встроеной с мембрану хлоропластасвоим С-концевым участком, взаимодействует с транскрипционными факторамисемейства WRKY (WRKY40,18,60), и этот комплекс способен модулироватьэкспрессию АБК-зависимых генов [Shang et al., 2010].Белок малой субъединицы CHL1 магний-хелатазы имеет сайты связывания109с тиоредоксином [Ikegami et al., 2007].
Эти белки, подверженные окислительновосстановительным превращениям, регулируют окислительно-восстановительныесостояния белков (редокс-состояния). В хлоропласте при освещении начинаетработатьцепьвосстановленныепереносаэлектронов,вмолекулыферридоксина,результатекоторые,чегоокисляясь,образуетсяпередаютэлектроны на тиоредоксин, активирующий хлоропластные ферменты [Тихонов,1999].
К настоящему времени накоплено немало экспериментальных фактов,свидетельствующих об участии большой субъединицы магний-хелатазы CHLH врегуляции биосинтеза хлорофилла. Помимо выполнения ферментативныхфункций – встраивания магния в молекулу ПП, она является звеном в передачесветовогоиретроградногосигналов,и,возможно,служитмишеньюфитогормона – абсцизовой кислоты. Фермент магний-хелатаза такженаходится под редокс-контролем - усиление его е активности на светупроисходит за счет тиоредоксин-опосредованной активации.Фотоэнзим биосинтеза хлорофилла сПОР регулирует зеленение.
Увысших растений индукция светом фермента сПОР запускает не только механизмсинтезахлорофилла,ноифотоморфогенез-процессформированияхлоропластных мембран из этиопластов. Внутренние мембраны этиопластовпроростков, выращенных в темноте, содержат протилакоиды и проламеллярноетело - крупное образование, в котором находится протохлорофиллид-голохром(комплексы, содержащие ПХЛД – одновременно субстрат и светособирающийпигмент, POR и НАДФН).
На свету начинается активный синтез ХЛД,проламеллярное тело дезинтегрируется, а протилакоиды превращаются втилакоидные мембраны, на которых формируются пигмет-белковые комплексыфотосистем [Беляева и Литвин, 2007]. Таким образом, только с началом синтезаХЛ в про-хлоропласт из цитоплазмы поступают ХЛ-связывающие белки.Генетическая детерминация механизма, обеспечивающего баланс синтезовпигментов и связывающих их белков в хлоропласте, остается пока предметом110экспериментальных иследований [Philippar et al., 2007].При изучении явления, названного «индуцированный длинноволновымкрасным светом блок процесса зеленения» (FRBG - Far Red block of greeningresponce), было показано, что фермент сПОР участвует в координации процессовфотоморфогенеза и синтеза хлорофиллов – зеленения [McCormac andTerry,2002].
Облучение длинноволновым красным светом (FR, λ>700 нм) проростковарабидопсиса, выращенных в темноте, ведет к стимуляции фотоморфогенеза запускаются процессы активации экспрессии ядерных и хлоропластных геновБФ, но не зеленения, поскольку FR не активирует сПОР. При этом количествомолекул фермента снижается и накапливается его субстрат - ПХЛД. В результатеу проростков укорачиваются гипокотили, но сохраняется желтая окраска.
Если ихпоместить на обычный свет, процесс зеленения замедляется или блокируется(когда длительность FR-облучения превышает 24 часа). Исчезновение PORAбелковсопровождалосьснижениемэкспрессиигеновHEMAиLHCB,кодирующих фермент GluTR и CAB- белки, соответственно. Сверхэкспрессиягена POR у трансгенных растений вела к супрессии FRBG-эффекта, чтопозволило сделать вывод об участии сПОР в регуляции экспрессии геновферментов синтеза ХЛ. Влияние этого фермента на формирование тилакоидныхмембран также обусловлено существованием в мембранах хлоропластов ПХЛДзависимых Toc/Tic транслоконов - белковых комплексов, через которые белки изцитоплазмы попадают в пластиды [Schemenewitz et al., 2007].Продукты фотосинтеза - сахара также вовлечены в обратную регуляциюэкспрессии ядерных генов, кодирующих БФ.
Низкое содержание сахаров вхлоропласте активизирует фотосинтез, тогда как их избыток стимулируетпроцессы роста и накопления углеводов [Oswald et al., 2001].Регуляция биосинтеза хлорофилла b. Фермент CAO. Хлорофилл b (ХЛb) дополнительный пигмент растений, водорослей и прохлорофит. В процессе егобиосинтеза происходит двухступенчатое окисление метильной группы ХЛДа или111ХЛа до формильной ферментом хлорофиллид/хлорофилл оксигеназа (CAO,chlorophyll a oxygenase) в присутствии кислорода [Tanaka et al., 1998].На тилакоидных мембранах хлоропластов световая энергия поглощаетсяпигмент-белковыми светособирающими комплексами (ССК) двух фотосистем.Основная часть молекул ХЛb входит в состав ССК фотосистемы 2 (ССК2).Растения строго контролируют соотношения ХЛа и ХЛb, которые варьируют от 3(в норме) до 4 (в условиях стресса).
Избыток мРНК ядерного гена CAO утрансгенных растений приводит к снижению этого соотношения до 2,7 иувеличению уровня экспрессии генов LHCB1-6 (light-harvesting chlorophyll a/bproteins) белков ССК2. По-видимому, транскрипции генов CAO и LHCBрегуляторно связаны [Tanaka and Tanaka, 2005].В составе фермента CAO три домена (A, B и C), из которых каталитическуюфункцию выполняет C-домен, тогда как A - участвует в контроле уровня белкаCAO в ответ на накопление ХЛb через протеалитическую деградациюхлоропластной протеазой CLP (сhloroplast protease) [Nakagawara et al., 2007;Yamasato et al., 2008].
У мутантов без ХЛb заблокирован импорт белков ССК изцитоплазмы в хлоропласт. Изучение этого явления позволило установить, что Адомен фермента CAO взаимодействует с субъединицами Toc/Tic транслоконов,влияя, таким образом, на транспорт белков в хлоропласт [Hoober and Eggink,2008; Reinbothe et al., 2006].1.7.7. Механизмы обратного ингибирования синтеза хлорофиллаПромежуточные продукты биосинтеза ХЛ фототоксичны. ПротопорфиринIX и его магниевые производные являются фотосенсибилизаторами – веществами,вызывающими образование реактивных форм кислорода (РФК)на свету[Красновский, 2001].
Их накопление приводит к фотодеструкции - фотоокислениюлипидов мембран и разрушению клетки. Один из основных механизмов регуляциихлорофиллобразования состоит в предотвращении избыточного накопления этих112интермедиатов путем обратного ингибирования синтеза первого предшественникаХЛ - АЛК гемом и протохлорофиллидом.Ингибирование протохлорофиллидом. Белок FLU.
Протохлорофиллид(ПХЛД) - субстрат фотофермента сПОР у высших растений. В темноте сПОР неработает, а накопление свободных молекул ПХЛД ведет к обратномуингибированию синтеза АЛК, и, соответственно, снижению активности всейсистемы синтеза ХЛ. Сравнительно недавно, с использованием генетическихподходов был обнаружен белковый компонент этой «регуляторной петли»,негативный регулятор биосинтеза тетрапирролов – белок FLU, который черезвзаимодействие с ферментом глутамил-тРНК редуктазой (GluTR) ингибируетактивность АЛК-синтезирующего комплекса [Meskauskiene et al., 2001; 2002].Под действием ЕМС были независимо получены 4 мутанта арабидопсиса снарушенной регуляцией - накапливающие в темноте избыточное количествоПХЛДа.
Они были названы flu-мутанты (fluorescent), из-за характерной яркокрасной флюоресценции ПХЛДа при облучении этиолированных проростковсиним светом (длиной волны 400–450 нм). Мутанты по этому гену накапливалипримерно в 10 раз больше ПХЛД и имели более чем в 3 раза увеличеннуюактивность АЛК синтезирующих ферментов. Сходный фенотип был описан в1974 году для мутантов ячменя tigrina [Nielsen, 1974], а ранее, в конце 50-х годов20 века, С. Граник обнаружил, что при добавлении экзогенной АЛК кпроросткам, растущим в темноте, в их клетках накапливается ПХЛД [Granick,1959]. Генетический анализ flu-мутантов показал, что все анализируемые мутацииаллельны и принадлежат одному ядерному гену FLU. Для его изоляции былииспользованыстратегиипозиционногоклонированияигеномнойкомплементации: ген был картирован, и мутантные растения трансформировалиДНК из библиотеки BAC-клонов, содержащих фрагменты участка хромосомы,маркированного мутацией.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
