Диссертация (1144823), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Тот же эффектнаблюдали при освещении растений дикого типа, обработанных ингибиторомбиосинтеза каротиноидов норфлюразоном (НФ) [Taylor, 1989] или антибиотикомлинкомицином, который подавляет трансляцию в хлоропластах [Ruckle et al.,2007].Дляобъясненияфактовподавленияэкспрессииядерныхгенов,контролирующих синтез хлорофиллов в ответ на блокирование функцийхлоропластов, было высказано предположение о существованиипластидныхфакторов, - сигнальных молекул, которые продуцирует хлоропласт для регуляции(позитивно или негативно) транскрипции ядерных генов [Batschauer et al., 1989].Поисками этих факторов ретроградного (из хлоропласта в ядро) пути передачисигналов занялись многие исследовательские группы, и наиболее значимые101результаты были достигнуты в экспериментах с применением генетическихметодов и подходов.Протопорфириныкаксигнальныемолекулыхлоропласта.Предположение о том, что в роли «пластидного фактора» могут выступатьпредшественники хлорофилла, впервые было проверено в экспериментахИоханингсмейера и Ховела [Johanningmeier and Howell, 1984].
Авторы провелисравнительное изучение экспрессии гена CAB1 у бесхлорофильных мутантовзеленойводорослиинтермедиатыхламидомонады:биосинтезаbrs1,хлорофилла:brc1иy-1,накапливающихпротопорфирин-IX(ПП),магний-протопорфирин IX (Mg-ПП) и ПХЛД, соответственно. В экспериментах такжеиспользовали культуры штаммов дикого типа, которые после обработкиингибиторами:левулиновойкислотойиα,α-дипиридиломнакапливали,соответственно, ранний предшественник – АЛК и Mg-ПП-монометиловый эфир(Mg-ППМЭ). Результаты экспериментов демонстрировали, что избыточноесодержание только одного интермедиата - Mg-ПП вело к ингибированиюсветовой индукции экспрессии гена CAB1.
Мутанты хламидомонады brs1 и brc1также были использованы в экспериментах Я. Кропат при изучении влияния ПП иMg-ПП на экспрессию генов белков теплового шока HSP70A и HSP70B [Kropat etal.,1997].Вработебылопоказано,чтоэкзогенныйППподавляетиндуцированную светом транскрипцию этих генов, а накопление Mg-ПП втемноте напротив, стимулировало (подобно свету) их экспрессию.Облучение проростков арабидопсиса длинноволновым красным светом внорме ведет к замедлению роста гипокотиля.
Мутанты с нарушеннымфотоморфогенезом, названные laf6 (long after far-red), в этих условияхформировалидлинныепроростки,укоторыхбылнарушенбиосинтезхлорофилла: они имели бледно-зеленую окраску и накапливали ПП. Мутация laf6блокировала ген, кодирующий хлоропластный АТФ-связывающий транспортныйбелок ABC-типа, который переносит ПП из мембран хлоропласта, где онсинтезируется, в цитоплазму [Moller et al., 2001]. Поскольку блокирование102транспортаППвызываетнарушенияфотоморфогенеза,можнобылопредположить, что для световой регуляции экспрессии ядерных генов БФнеобходимо присутствие ПП в цитоплазме. Методом конфокальной лазернойспектроскопии в экспериментах по визуализации интермедиатов хлорофилла: ППи Mg-ПП, удалось показать, что в условиях фотоокислительного стресса (приосвещении обработанных норфлурозоном (НФ) проростков арабодопсиса) MgПП накапливался в хлоропласте и цитоплазме, а ПП – в цитоплазме [Ankele et al.,2007].
Отсутствие этих предшественников хлорофилла в ядре исключаловозможность их прямого влияния на транскрипцию ядерных генов. По-видимому,протопорфирины в цитоплазме взаимодействуют с регуляторными белками,опосредованно снижая экспрессию ядерных генов БФ. Накопление ПП и Mg-ППв условиях фотодеструкции хлоропластов (НФ+свет), также ведет к подавлениюэкспрессии ядерных генов белков светового стресса ELIP [Погульская и др., 2006;Осипенкова и др., 2007] и белков SIG1-6 - компонентов хлоропластной РНКполимеразыPEP, которая преимущественно транскрибируетгены БФ упроростков дикого типа, [Ankele et al., 2007].Участие Mg-ПП в репрессии транскрипции ядерных генов БФ активнообсуждается с 1984 года [Johanningmeier and Howell, 1984].
Гипотеза, согласнокоторойэтотпигментявляетсянегативнымсигналом,продуцируемымхлоропластом, в случае его дисфункции, считались почти доказанной вплоть до2008 года, когда в журнале PNAS (v. 105) появилось две экспериментальныестатьи, ставящие под сомнение это утверждение. Японские исследователи,работая с мутантами арабидопсиса, не обнаружили прямой корреляции междунакоплением Mg-ПП и уровнем экспрессии ядерных генов: CAB, RBCS, GluTR идругих, существенных для фотосинтеза [Mochizuki et al., 2008]. Их английскиеколлеги [Moulin et al., 2008] не нашли Mg-ПП в растениях арабидопсиса, укоторыхв условияхфотодеструкции(НФ+свет), экспрессиягенов БФрепрессирована. Напротив, искусственное повышение уровня эндогенныхпротопорфиринов за счет добавления АЛК, - прием, известный со времен С.103Граника [Granick, 1959], вело к усилению экспрессия генов БФ.
Эти данныесвидетельствуют, что роль протопорфиринов в передаче сигналов из хлоропластав ядро еще предстоит выяснить.FNR- фактор транскрипции, регулирующий синтез тетрапирролов ванаэробных условиях [Ouchane et al., 2007]. При недостатке кислорода на свету онактивирует транскрипцию генов HEMN и BCHE, кодирующих независимые откислорода ферменты синтеза хлорофиллов: копропорфириноген III- дегидрогеназуи магний-ПП-монометилциклазу, соответственно.Нарушения путей передачи сигналов из хлоропластов в ядро.
GUNмутанты. Роль Mg-ПП как сигнальной молекулы хлоропластной природы,влияющей на регуляцию экспрессии генов ядра (рисунок 1.25), активнообсуждалась и при изучении мутантов арабидопсиса по ретроградному контролю,названых gun (genomes uncoupled) [Susec et al., 1993]. У этих мутантовтранскрипция ядерных генов CAB и RBCS, кодирующих белки хлоропласта,сохраняется (в отличие от нормальных растений) в условиях фотодеструкциихлоропластов – при освещении обработанных норфлюразоном проростков. Дляполучения gun-мутантов использовали трансгенные растения арабидопсиса, укоторых промотор гена CAB1 контролировал экспрессию двух репортерныхгенов, позволяющих легко тестировать его активность по устойчивости кантибиотику [Susec et al., 1993].
Трансгенные семена обрабатывали мутагеном –этил-метансульфонатом (ЭМС) и отбирали gun-мутанты, у которых экспрессиятрансгена CAB сохранялась в условиях фотодеструкции. Изучение пяти такихмутантов показало, что гены, затронутые gun-мутациями, кодируют белки,участвующие в биосинтезе тетрапирролов.
Мутация gun5 представляет собойзамену нуклеотидов (С-Т) в гене CHLH большой (H) субъединицы магнийхелатазы (МХ), которая ведет к замене аминокислот А990V в белке CHLH[Mochizuki et al., 2001]. Продукт гена GUN4 оказался способен in vitro связыватьПП и стимулировать активности МХ и АЛК-синтезирующего комплекса [Larkin104et al., 2003; Verdecia et al., 2005; Adhikari et al., 2011].Мутанты арабидопсиса с удлиненными гипокатилями: hy1 и hy2 (longhypocotile), изолированные как формы c нарушенными функциями фитохромов,имели бледно-зеленую окраску, и демонстрировали gun-фенотип. Одноименныемутации оказались аллельными мутациям gun2 и gun3, соответственно [Vinti et.al., 2000]. Гены, маркированные мутациями hy1/gun2 и hy2/gun3, кодируютферменты биосинтеза фитохромобилинов: гем-оксигеназу [Muramoto et al., 1999;Davis et al., 1999] и фитохромобилин синтетазу [Kohchi et al., 2001],соответственно.
Мутанты по обоим генам накапливали гем, и снижение уровняхлорофилла в их листьях объясняли свойством гема подавлять синтез АЛК попринципу обратного ингибирования (рисунок 1.21). Тот факт, что у нихзаблокирован синтез хромофоров фитохромобилинов (в составе фитохромов онизадействованы в пути передачи светового сигнала), свидетельствовал овзаимодействии путей светового и хлоропластного сигналов. Эта взаимосвязьбыла показана и сотрудниками лаборатории Роберта Ларкина [Ruckle et.
al., 2007],которые среди вновь полученных gun-мутантов отобрали формы с удлиненнымигипокотилями - мутанты по фоторегуляции. Четыре таких мутанта неслиаллельные мутации в гене CRY1, кодирующем фоторецептор синего светакриптохром. Мутанты сry1 имели «неполный» gun-фенотип: увеличение на 5-10%по сравнению с диким типом уровня экспрессии генов CAB в условияхдеструкции хлоропластов (за 100% был принят уровень такой экспрессии урастений с нормальными хлоропластами – не обработанных линкомицином).Мутация gun1 затрагивает ген GUN1, который кодирует ДНК-связывающийбелок хлоропласта [Koussevitzky et al., 2007].
По мнению авторов, GUN1 работаетв пути передачи пластидного сигнала, в результате включения которого факторытранскрипции, один из которых известен - ABI4 (abscisic acid-insensitive 4),связываясь с G-боксами промоторов генов БФ, подавляют их экспрессию. Такимобразом, G-боксы промоторов генов БФ являются, по-видимому, общими дляпутей световых сигналов и сигналов хлоропласта (по крайней мере, в зависимом105от GUN1 пути передачи ретроградного сигнала). Для выяснения механизмоввзаимодействия этих путей, контролируемых GUN1 и CRY1, в условияхдеструкции хлоропластов, был сконструирован и исследован двойной мутантгенотипа: gun1,cry1 [Larkin and Ruckle, 2008]. Его проростки имели 100% gunфенотип, - при освещении синим светом, уровень экспрессии LHCB (CAB)-генапосле обработки линкомицином у них был таким же, как у растений дикого типа,не обработанных антибиотиком.
Это означало, что при освещении растенийсиним светом GUN1 и СRY1 полностью отвечают за репрессию генов CAB. Болеетого, оказалось, что CRY1 репрессирует транскрипцию CAB-гена в условияхдисфункции хлоропластов путем переключения активности (с позитивной нанегативную) фактора HY5.Рисунок 1.25. Пути передачи ретроградных (из хлоропласта в ядро) сигналов вфотосинтезирующей клетке.
Экспрессию ядерных генов БФ, кодирующих белкисветособирающих комплексов (CAB), ферментов биосинтеза хлорофилла (CHLs) ималой субъединицы рибулозобифосфат- карбоксилазы (RBCS) регулируют «факторыхлоропласта» - тетрапирролы: протопорфирин IX (ПП), магний-протопорфирин IX(Mg-PP), и молекулы белков (в виде овалов). Вопросительные знаки означают еще необнаруженные факторы, «работающие» в путях передачи сигналовНапомним, что по современным представлениям, криптохромы активируют106экспрессию ядерных генов - при освещении они запускают механизмдезактивации COP1-протеаз, связывающих активатор транскрипции генов БФHY5 [Deng et al., 1992]. Все исследованные одиночные и двойные мутантыгенотипа: cry1, gun1, cry1,gun1 и cry1,hy5 демонстрировали нарушения биосинтезахлорофилла в процессе зеленения – при освещении выращенных в темнотепроростков, свидетельствуя, на наш взгляд, о тесном взаимодействии биосинтезапигментов хлоропласта и путей передачи световых и хлоропластных сигналов,регулирующих экспрессию ядерных генов биосинтеза ХЛ.
Таким образом, Gunмутации нарушают пути передачи ретроградных сигналов (из хлоропласта вядро)затрагиваягены,продуктыкоторыхучаствуютвподавлениисветоиндуцированной экспрессии CAB-генов в условиях деструкции хлоропластов.Изучениеgun-мутантовпоказало,чтоприразрушениихлоропластовблокирование экспрессии ядерных генов БФ на свету осуществляют следующиебелки хлоропласта: GUN1, GUN5 (CHLH – большая субъединица магнийхелатазы), GUN4 – мембранный белок, связывающий интермедиаты синтезахлорофилла: ПП и Mg-ПП, ABC1 – белок-транспортер ПП из цитоплазмы вхлоропласт; ферменты синтеза фитохромов: GUN2 – гем оксигеназа, GUN3 –фитохромобилин синтетаза, и CRY1 - фоторецептор синего света криптохром..1.7.6. Этапы биосинтеза, существенные для механизмов регуляцииДля регуляции уровня содержания хлорофиллов в растительной клеткенаиболее существенны следующие шаги биосинтеза тетрапирролов (Рис.1.21):а) синтез АЛК – первого специфического продукта в биосинтезететрапирролов;б) включение металлов (Mg2+ или Fe2+) в молекулу протопорфирина IX –последнего общего предшественника хлорофиллов и гема, соответственно;в) фотоконверсия ПХЛД – строго светозависимый процесс у высшихрастений;107г) биосинтез хлорофилла «б».Синтез АЛК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
