Диссертация (1144823), страница 23
Текст из файла (страница 23)
Освещали препарат методом световогозонда: сверху через объектив микроскопа. Использовали световой зонд диаметром2 мкм, который при объективе 40х и окуляре 8х имел площадь, примерно равнуюполовине хлоропласта. Препараты переносили на предметный столик МУФ-5 и124выбранный объект «накрывали» зондом, ориентируя его в участок, гдерасположен хлоропласт. Запись проводили на малой скорости – 2,5 нм/сек,которая дает четкую картину в видимой области спектра. Рядом с записьюобъекта записывали фоновое поглощение – поглощение участка без клетки дляучета рассеивания, вызванного предметным стеклом и агаром.
Величинуэкстинкции (Е) измеряли при длинах волн (λ): 440 нм, 480 нм, 560 нм, 660 нм.Расчеты проводили в условных единицах, измеряя высоту пиков поглощения вмиллиметрах, вычитая фон для каждой точки и относя полученную величину кэкстинкции в полосе 560 нм – условной мере светорассеяния и неспецифическогопоглощения света.Спектральные характеристики индивидуальных клеток получали также спомощью микроспектрофотометра SMS-03 фирмы «Opton» (ФРГ) с системойобработки данных «IBAS-1».
В этом случае регистрировали оптическуюплотность в полосе светорассеяния при 560 нм и в максимуме поглощения ХЛа при 680 нм. Соотношения Е680/Е560 использовали как показатель накопленияхлорофиллов в клетках хламидомонады.2.9. Определение качественного и количественного состава порфириновОценка качественного состава порфиринов. К водной суспензии клеток C.reinhardtii (5 мл) добавляли 50 мл смеси этилацетата и ледяной уксусной кислоты(4:1 v/v), встряхивали в течение 3-х минут и помещали на 12 часов в темноту при4 °С. Разделение порфиринов на фракции и получение их солянокислыхрастворов: протопорфирина IX (ПП) – в 1,5 М HCl и в 0,1 М HCl; уропорфирина –в 0,5 М HCl, проводили по методу Римингтона с модификациями [Falk, 1961].Флуорисценцию порфиринов регистрировали на спектрофлуориметре УЛФ,изготовленном КБ АМН СССР, возбуждая ее длиной волны 405 нм.
В рядеслучаев, после доведения рН солянокислого раствора ПП до 3,2 – 3,6 пигментпереводили в диэтиловый эфир и записывали спектры поглощения наспектрофотометре UV-800 фирмы «Shimadzu».125Хроматографию порфиринов проводили на бумаге FN-1 фирмы «Filtrak» всистеме растворителей 2,6-лутидин-вода (5:3 v/v) в атмосфере аммиака.
ВкачествестандартныхпигментовиспользовалиППфирмы«Serva»ибактериальный копропорфирин, полученный от В. Я. Быховского (Институтбиохимии им. А. Н. Баха АН СССР).Количественное определение магниевых производных ПП. Клеточнуюмассу C.reinhardtii в фарфоровой ступке растирали с СаСО3 под слоем 100%ацетона. Полученный гомогенат центрифугировали (6000 g, 15 минут), а затемдоводили содержание ацетона в супернатанте до 85% 0,1 N раствором NH4OH.Разделение пигментов на фитольные и бесфитольные формы проводили спомощью гексана по методике Авериной [Аверина и др., 1980]. Содержаниепредшественников хлорофилла (МПЭ, ПХД, ХДа) и ХЛа в щелочном ацетоне,отмытом гексаном, рассчитывали из спектров флуоресценции [Shlyk et al., 1982].Содержание ХЛа и ХЛb в гексане рассчитывали из спектров поглощения,используя формулы, выведенные для этих пигментов в диэтиловом эфире [Falk,1961].Для оценки продуктивности мутантов хламидомонады по протопорфиринуIX (ПП), 8 мл водной суспензии клеток обрабатывали ультразвуком (22 кГц, 90сек), заливали 8 мл 3N HCl и центрифугировали (6000 g, 15 мин).
КонцентрациюПП определяли после регистрации оптической плотности (Е) растворов при 380нм, 407 нм и 430 нм по формуле:ПП (нмоль) = (2Е407 – (Е380 + Е430))·2,2·V2.10. Определение АЛК-синтетазной активностиКультуры клеток С. reinhardtii выращивали в жидкой среде в течение 5 дней,затем собирали центрифугированием и переносили в свежую среду с добавкой0,004 М левулината кальция. Через 24 часа клетки осаждали и определяликоличество накопленной АЛК в осадке и в супернатанте отдельно.
Клетки126заливали 5% ТХУ (2 мл) и кипятили на водяной бане (15 минут), затем осаждалицентрифугированием. Осадок промывали ацетатным буфером (буфер составлял ½v ТХУ) и центрифугировали (15 минут, 7000 g). Супернатанты объединяли,добавляли 3-4 капли ацетил-ацетона, кипятили 15 минут и центрифугировали.Супернатант сливали в мерную пробирку, из которой брали 2 мл, добавляли 2 млраствора Эрлиха и через 15 минут снимали показания оптической плотности этихрастворов в области 555 нм на спектрофотометре.
К культуральной жидкостидобавляли ТХУ до конечной концентрации 5%, добавляли ацетат натрия до рН4,5 и наносили на ионо-обменную колонку. После конденсации на колонке, элюатсобирали в мерные пробирки по 2 мл (12-15 пробирок). В каждую пробиркудобавляли по 0,2 мл ледяной уксусной кислоты и 3 капли ацетил-ацетона. Послеих кипяцения (15 минут)в пробирки добавляли раствор Эрлиха (1:1 v/v) иснимали показания оптической плотности в полосе поглощения АЛК-пиррола –555 нм. Концентрацию АЛК определяли по формуле:АЛК (нмоль) = Д·2v·14,71;где Д – поглощение в области 555 нм [Miller et al., 1979].2.11. Определение содержания протогема в клетках C. reinhardtiiКлетки С.
reinhardtii осаждали центрифугированием и при –18 ºС заливалиохлажденным щелочным ацетоном (ацетон : 0,1 М NH4OH, 9:1 v/v), переносилина фильтр Шота и проводили последовательную экстракцию пигментовщелочным ацетоном (трижды) для элиминации хлорофиллов и каротиноидов. Вусловиях низких температкр (18 ºС) гем из клеток не вымывается, и его извлекаликислым ацетоном (ацетон - концентрированная HCl, в объемных соотношениях 49: 1).
Проводили экстракцию трижды, каждый раз приливая по 5 мл кислогоацетона. Объединенный экстракт испаряли в роторном испарителе. Для удаленияостатков HCl осадок растворяли в 100% ацетоне и вновь испаряли. Остатокрастворяли в 7 мл щелочного пиридина (20 мл пиридина в 30 мл 0,2 М КОН) иразделяли на две кюветы: в первую добавляли твердый дитионид натрия и через127двеминутыснималивосстановленногодифференциальныепиридин-голохромапри557спектрыи540окисленногонм,ииспользуяспектрофотометр Shimadzu (Япония).
Количество гемма рассчитывали поформуле:Гем (нмоль) = 103·V(мл) ·ΔE/20,7 (mM),где V – объем щелочного пиридина: ΔE – разница в поглощении при 557 и549 нм в дифференциальном спектре [Falk, 1964].2.12. Определение активности магний-хелатазыКлетки С. reinhardtii ресуспензировали в 0,5 мл буфера для инкубирования(сорбитол – 0,5M, трицин – 0,05M, EDTA – 1 mM, MgCl2 – 1mM, BSA – 0,1%,DTT – 1 mM), культивировали 1 час при комнатной температуре иаликвотировали (в расчете 120 мкл на пробу) по четырем пробиркам: 1 – контрольи триопытных образца. В полной темноте к клеткам добавляли по 20 мклкаждого из элементов субстрата: Креатин-фосфат – 60 mМ, АТФ магниевая соль –4 mM, Креатин фосфокиназа – 0,8 единиц активности на 200 мкл буфера,протопорфирин IX – 10 μМ раствор в DMSO. В контрольную пробиркудобавляются все компоненты, кроме протопорфирина IX – основного субстратафермента МХ, запускающего реакцию.
Реакция проходит в темноте при 30 ˚С припомешивании (термостатируемый шейкер) 30 -35 минут. Фиксацию материалаосуществляют паром (2 мин) и ацетоном - в каждую пробирку с 200 мклреакционной смеси добавляют 800 мкл ацетона. Пигменты из фиксированныхклеток экстрагировали, добавляя щелочной ацетон (ацетон : 0,1 М NH4OH, 9:1v/v) до полного вымывания. Промытая гексаном фракция ацетона используетсядля определения концентрации пигмента магний-протопорфирина IX - продуктафункционирования фермента магний-хелатазы. Скорость накопления этогоинтермедиата относят к количеству клеток, участвующих в реакции.1282.13. Выделение и анализ нуклеиновых кислот из C.
reinhardtiiПолучение нуклеиновых кислот. Для выделения ДНК из клеточнойкультуры C. reinhardtii успешно применяется метод CTAB, когда в составеэкстракционного буфера используется цетилметиламмоний бромид (ЦТАБ) –детергент, разрушающий клеточные мембраны и образующий комплексы сбелкамиикислымиполисахаридами.Клетки,ресуспензированныевэкстрагирующем буфере, 100 мл которого содержат: ЦТАБ – 2 гр, 5 М NaCl - 28мкл, 0,5 М EDTA (pH8) - 4 мл, 2 M Тris-HCl (pH 8) – 5 мл, культивировали,помешивая, при 56°С в течение одного часа.
После депротеинизациихлороформом нуклеиновые кислоты осаждали изопропанолом, а, затем, последополнительной очистки, – этанолом. Просушенные образцы ДНК растворяли вбуфере ТЕ, хранили в холодильнике (+4 °С) и использовали для ПЦРамплификации генов интереса и Саузерн-блот гибридизации. Тотальную РНК изклетокC.reinhardtii,находящихсявэкспоненциальнойфазероста,экстрагировали реагентами набора «YellowSolve» фирмы Cилекс в соответствии синструкцией производителя.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
