Диссертация (1144823), страница 24
Текст из файла (страница 24)
Полученные РНК использовали для Нозерн-блотгибридизации и для ОТ-ПЦР.Гибридизация по Саузерну. Образцы ДНК обрабатывали эндонуклеазамирестрикции, разделяли полученые фрагменты в агарозном геле (0,8%) в буфереТAE (tris/acetate/EDTA) и переносили на нитроцеллюдозные фильтры, которыезатем гибридизовали с радиоактивными ДНК-зондами. Зонды получали методомслучайных праймеров с использованием [32P]dCTP (Gibco-BRL, Eggenstein,Германия) и ДНК-полимеразы I из E. coli (AP-Biotech, Freiburg, Германия).Нозерн-блот гибридизация. При подготовке к гибридизации образцы (1220 мкг тотальной РНК), разделяли в 1%-ном агарозном геле, содержащемформальдегид,переносилинанитроцеллюлозныйфильтрHybondN+игибридизовали с радиоактивно-мечеными кДНК-зондами. Гибридизационные129сигналы регистрировали с помощью фосфоимиджера (Molecular Dynamics,Krefeld, Германия).Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
ПЦР-амплификацию проводили наприборе Терцик (ДНК-Технологии, Москва). Реакции ставили в 50 мкл смеси,содержащей 0,2 µМ специфичных праймеров, 2mM dNTP и 5 единиц ферментаTaq-полимеразы (Силекс, Москва) в соответствующем буфере. Полученныепродукты ПЦР (ампликоны) анализировали методом гель-электрофореза в 1,2%агарозном геле в буфере TBE (tris/borate/EDTA), клонировали в вектор pGEM-T(Promega, USA) и секвенировали.ОТ-ПЦР. Метод обратной транскрипции, совмещенной с ПЦР (ОТ-ПЦР),включает синтез кДНК на матрице тотальной РНК (после предварительнойобработки ДНК-азой), используя фермент обратная транскриптаза M-MLVфирмыСилекс (Москва) и олиго-dT праймеры по протоколу производителя.
На матрицеполученной кДНК проводили ПЦР с ген-специфичными праймерами для оценкиуровня транскрипции генов интереса.Секвенирование. Определение нуклеотидных последовательностей пометоду Сэнджера проводили на Генетическом анализаторе ABI Prism 310 (фирмыApplied Biosystems).2.14. Вестерн-блот анализБелки из клеток хламидомонады экстрагировали в раствор, содержащий:2%-ный додецилсульфат Na, ДТТ – 56 мМ, Na2CO3 – 56 мМ, 12%-ую сахарозу, 2мМ этилендиаминтетраацилацетат. Гомогенат центрифугировали при 6000 g втечение 5 мин.
Надосадочную фракцию далее хранили при температуре –20 ºС.Электрофорез белков проводили в 12,5%-ном полиакриламидном геле сдобавлением 2%-ного додецилсульфата Na. После разделения осуществлялиэлектроперенос белков с геля на нитроцеллюлозную мембрану HybondP+.Иммунодетекциюбелковнанитроцеллюлозноймембранепроводилисиспользованием специфичных для анализируемых белков антител, и вторичных130антител, конъюгированных или со щелочной фосфатазой, либо с пероксидазой.Антитела для ферментов биосинтеза тетрапирролов были любезно предоставленыпрофессором Б.
Гриммом (Bernhardt Grimm, Университет им. Гумбольдта,Берлин, Германия). Обработку изображений результатов иммуноблотингапроводили с помощью программы «Total Lab 2.01» (США).2.15. Трансформация клеток методом «стеклянных шариков»КлеткиC.reinhardtiiвэкспоненциальнойфазеростаосаждалицентрифугированием (5000 g, 5 мин.), ресуспензировали в растворе автолизина доконцентрации 3х107 кл/мл и пультивировали при слабом перемешивании втечение 2-4 часов до тех пор, пока не произойдет растворение клеточныхоболочек автолизином.
Отсутствие клеточных стенок тестировали, добавляя кклеткам равный объем 1% раствора тритона, – такие клетки разрушаются втечение 1 мин. Клеточную суспензию (0,3 мл) помещали в эппендорфы состеклянными шариками (0,5 мм диаметре), в которую затем добавлялитрансформируемую ДНК (плазмидную ДНК или ДНК из ВАС-клонов).Содержимое сильно встряхивали на вортексе в течение 20-30 секунд, добавлялисвежую среду (0.3 мл) и переносили на чашки Петри с агаризированнойселективной средой для культивирования. Результаты учитывали через 10-15дней. Клоны геномной библиотеки BAC-клонов C.
reinhardtii были получены изресурсного центра Института генетики Университета г. Клемсон (CUGI, USA)http://www.genome.clemson.edu. ДНК из BAC-клонов, содержащая маркерный генустойчивости к хлорамфениколу, быламутантныхклетокметодомиспользована для трансформации«стеклянныхшариков»[Rymarquis,2005].Трансформированные клетки высевали на среду ТАР и выращивали в темнотепри 24 °C.
Зеленые в темноте трансформанты проверялись на устойчивость кхлорамфениколу.1312.16. Время генерации культурВремя генерации (ВГ) культур рассчитывали по формуле:ВГ (час.) = 11 + 0,75 ВД,где ВД – время удвоения численности клеток в культуре [Harris, 1989].2.17. Получение автолизинаАвтолизин (или гаметолизин), – вырабатываемый гаметами C. reinhardtiiбелок размером 638 аа, – обладает протеазной активностью.
Он относится к Znсодержащим металлопептидазам и существует в двух формах – неактивная Vформа – в вегетативных клетках, и активная G-форма образуется пригаметрогенезе на среде без азота. Для получения автолизина используют хорошоскрещивающиеся штаммы СС-620 и СС-621 из коллекции CGC (ChlamydomonasGenetic Center).
После гаметогенеза (24 часа в среде без азота на свету), гаметыобоих штаммов сливают, и копуляционную смесь оставляют на свету в течение 24 часов. Затем, клетки осаждают центрифугированием (4 °C, 10000g), асупернатант, содержащий автолизин, очищают, пропуская через фильтры (0,250,45 мкм), аликвотируют (по 50 мл) в стерильную посуду и хранят вморозильнике (–20 °С).2.18. Статистическая обработка данныхВ работе использованы стандартные биометрические методы [Глотов и др.,1982].
Для статистической обработки экспериментальных данных и учетаполученных результатов использовали пакеты программ «Statistica 6.0», «Exсel2003», «SigmaPlot 9.0», и статистические методы, принятые в областибиологических исследований. Статистическая обработка данных состояла вопределении средней квадратичной ошибки их среднего.1322.19. Компьютерные программы и базы данныхИнформационные ресурсы баз данных генетической информации икомпьютерные программы сравнительного анализа структуры и функций молекулДНК, РНК и белков, использованные в работе, доступны в интернете по адресам:NCBI - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi;ExPASy Proteomics Server - http://www.expasy.ch/tools;Базы данных генетического центра хламидомонады (CGC, Chlamydomonas GeneticCenter) и геномного проекта хламидомонады (JGI, Joint Genome Institute)находятся:http://www.chlamy.org/index.html;http://genome.jgi-psf.org/Chlre4/Chlre4.home.html.133Раздел 3.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ3.1. Генетико-биохимические исследования хлорофильных мутантовхламидомонады, накапливающих порфириныНа кафедре генетики и биотехнологии биологического факультета СПбГУболее сорока лет ведутся исследования зеленой одноклеточной водорослихламидомонады (С.
reinhardtii) – модельного объекта генетики фотосинтеза.Эксперименты А.В. Столбовой [Столбова, 1971] положили начало созданиюуникальной коллекции пигментных мутантов С. reinhardtii, что позволилоизучать генетический контроль пигментов хлоропласта – хлорофиллов (ХЛ) икаротиноидов. Настоящяя работа посвящена исследованиям бесхлорофилльныхмутантов,накапливающихбиосинтетическийпредшественникХЛ–протопорфирин IX (ПП), который вместе с каротиноидами придает клеткаморанжевую окраску. Генетический анализ показал, что накопление ПП у этихмутантов обусловлено рецессивными мутациями в двух ядерных генах: CHL1 иLTS3, представленных рядом аллелей [Чекунова и Квитко, 1986; Чекунова иЧунаев, 1990]. В отличие от гибнущих на свету мутантов по гену CHL1генотипа: chl1 и brs-1, культуры штаммов С.
reinhardtii, несущих аллельныемутации lts3 и brc-1 в гене LTS3, при освещении зеленеют, сохраняя способностьк биосинтезу хлорофилла на свету. Биохимические и молекулярно-генетическиеисследования мутантов хламидомонады по генам LTS3 и CHL1 (позднеепереименованного в CHLH), позволили автору клонировать эти гены иопределить функции кодируемых ими белков [Chekunova et al., 2001; Чекунова,Савельева, 2010].1343.1.1.
Первичная характеристика мутантов3.1.1.1. Мутанты хламидомонады, использованные в работеОсновой Петергофской генетической коллекции (ПГК) пигментных мутантовС. reinhardtii [Квитко и др., 1983] стали штаммы, полученные АннойВладимировной Столбовой, в лаборатории генетики микроорганизмов БиНИИЛГУ. В результате экспериментов по химическому мутагенезу она изолировала 97мутантов, индуцированных нитрозоэтилмочевиной (НЭМ), два из которых: N-19и N-122 были описаны как «оранжевые в темноте» [Столбова, 1971]. Позднее,П.Х.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
