Диссертация (1144823), страница 27
Текст из файла (страница 27)
Для локализации этих генов на генетической карте C. reinhardtiiштаммы, несущие изучаемые мутации, скрещивали с ауксотрофными имножественно-маркированнымилиниями(таблицамейотическое потомство методом тетрадного анализа.3.8)ианализировали148Таблица 3.8.
Характеристика скрещиваний хлорофильных оранжевыхмутантов на множественно-маркированные линии хламидомонадыТетрадный анализЧислоШифрПрорастаемость (%)полныхзиготспортетрадС1429 430*1419-1в (or13)486850С1430 430*494/3 (or3)387450С1436 430*782-6 (chl1-19)948980С1439 Д-2/5-16 (or2/5)1430-25a**956433С1428 Арг2 (arg7-8)1419-1в (or13)969720С1433 1425-23 (lts3)Арг7 (arg7)9710080С1495 1490-17 (or13,ery3)М-3 (msr-1)977496С1501 1495-47г (or13,ery3)Арг7 (arg7)929860С1526 137С (wt)1501-37б314430С1489 1482-2е (chl1)A-3 (act2)819150С1496 1482-2е (chl1)CC1336***286935С1497 1482-2е (chl1)521-8г (cbn1)24619* - штамм 430 – множественно-маркированный, генотипа: pf2, nic13, msr1, act2, mt+;** - штамм 1430-35а – рекомбинант штамма 430, генотипа: pf2, nic13, msr1, act2, mt-;*** - штамм СС1336 имеет генотип: pf14, nic7, act2, mt+;Прим.
– частота «зеленых» тетрадCкрещиванияРодители (штамм и генотип)mt+mt-Прим.(%)174202110010021100341415В таблице 3.9 представлены результаты тетрадного анализа зигот скрещиванийC1429 (c участием мутации or13 в гене LTS3), и С1430, С1436 и С1439 (мутации: or3,chl1-19, or2/5, соответственно, в гене CHL1). Проверка на сходимость расщепленийдля последних трех мутаций позволила их суммировать в графе «CHL1». Данныеэтой таблицы демонстрируют отсутствие сцепления мутации or13 в локусе LTS3 смаркерами VI, X, XI групп сцепления, и слабое сцепление (33 сМ) с маркером msr-1группы сцепления I. Соотношение родительских (Р) дитипов и неродительских (N)дитипов достоверно не отличаются от 1:1 во всех вариантах, кроме пары маркеровlts3 - msr-1 (P0,001).149Таблица 3.9.
Результаты тетрадного анализа зигот скрещиваний ХОМ смаркированными линиями хламидомонадыМаркеры и их локализация:LTS3CHL1МаркерГруппа сцепления*P:N:T**P (P=N)P:N:T**P (P=N)msr-1I /43/29:7:305:11:27 0,01 0,95pf-14VI /12/3:2:9 0,95act-2VI /44/7:8:1725:12:43 0,99 0,05nic-13X /3/3:5:127:9:9 0,95 0,95pf-2XI /2/7:7:1818:18:35 0,99 0,99mtVI /24/18:17:47*** 0,99*- в скобках даны расстояния маркера от центромеры (в сантиморганах - сМ);** - соотношения тетрад родительских (Р) дитипов, неродительских (N) дитипов итетратипов (Т); *** - нерегулярное расщепление3.1.2.5. Использование анеуплоидии для картирования мутацийПосле установления слабого сцепления локуса LTS3 с дистальным маркеромхромосомы I, в генетический анализ были включены еще несколько маркеровэтой хромосомы.
В потомстве скрещиваний штаммов, несущих мутации or13 иlts3-122, с мутантами по локусу ARG7 обоих типов спаривания (С1428 и С1433),отсутствовало расщепления по анализируемым признакам. Все споры былизеленые, аргининзависимые и имели тип спаривания mt-. После включения всхему скрещиваний (С1501) еще одиного маркерахромосомы I – ery3, впотомствеспорытакженаблюдалиединообразие:всебылизеленые,аргининзависимые и эритромицин-чувствительные. Такие клетки по параметрамтипа спаривания (mt-) и среднего объема клетки (200 – 240 мкм), соответствовалидиплоидам. По-видимому, в этих скрещиваниях формировались вегетативныедиплоиды, у которых гетерозиготное состояние по локусам:lts3, ery3 и mtсопровождалось сохранением ауксотрофности по аргинину. Гетерозиготность повышеперечисленным маркерам была подтверждена в гибридологическом анализесегрегантов из ―зеленых‖ тетрад.
В семейном анализе потомства скрещивания150такого ―зеленого‖ сегреганта 1501-37б (mt+) на штамм дикого типа (С1526),22,3% зигот выщепляли оранжевые сегреганты. Анализ клонов из случайнойвыборки зооспор этого скрещивания показал, что в генотипе диплоида 1501-37бприсутствует одна аллель гена ARG7, - 12% всех проверенных зеленых клоновоказались аргининзависимыми и устойчивыми к эритромицину при росте на свету(таблица 3.10). В темноте, на среде с эритромицином такие клоны гибли.Расщепление маркеров ery-3 и msr-1 группы сцепления I хламидомонады всочетании с мутацией or13 (локус LTS3) анализировали в потомстве С1495, гдедвойноймутантгенотипа:or13,ery-3,mt+скрещивалисустойчивымкметионинсульфоксиимину штаммом М-3. В этом случае также наблюдалиотклонения от менделевского расщепления по маркерам хромосомы I, присохранении его по маркеру mt хромосомы VI (таблица 3.11).Появление в мейотическом расщеплении тетрад типа: 0+ : 4- и 1+ : 3- помаркеру msr-1 позволило предположить, что родительский штамм М-3 – дисомикпо хромосоме I, и мы анализируем расщепление трисомика (++-)по группесцепления I.
Наблюдаемые при этом отклонения от менделевского расщепления(2+ : 2-) по нелокализованному маркеру or13 могут служить подтверждением еголокализации в хромосоме I [MacMartin, James, 1979].Таблица 3.10. Результаты анализа потомства скрещивания С1526 (случайнаявыборка)Анализируемые клоныФенотипчислоОранжевыеЗеленые6465Частота клонов (%) фенотипа (генотипа):АргининУстойчивых кДвойныхзависимых (arg7-)эритромицинумутантов:R(ery3 )(arg7-, ery3R)50%36%16%12%12%12%151Таблица 3.11. Тетрадный анализ скрещивания С1495Пары маркеровor13/or13+ery3/ery3+msr-1/msr-1+mt+/mt-ГруппасцепленияIIVI0+ : 40020Число тетрад типа:1+ : 32+ : 23+ : 1062601012717204904+ : 011720Всеготетрад43293149Среди зеленых сегрегантов в потомстве С1495 было два типа клонов:стабильные и нестабильные – выщепляющие оранжевые клоны, и вероятно,гетерозиготные по мутации or13.
Генотип зеленых дисомиков определяли поокраске колоний, которые появлялись в рассевах их культур. В рассевахдисомиков генотипа: or13+/or13+ росли только зеленые клоны, у гетерозиготгенотипа: or13+/or1 ˗ зеленые и оранжевые клоны, клоны генотипа: or13/or13 ˗всегда оранжевые. Мутация or13 проявляет слабое сцепление с центромерой(таблица 3.9). При вычислении теоретически-ожидаемого расщепления по этомулокусу при тривалентной коньюгации предполагается, что после прохождениякроссинговера, у центромеры с равной вероятностью может оказаться любая параиз 6-ти аллелей гомологичных хроматид тривалента.
Статистическая обработкарезультатов скрещивания С1495 показывает (таблицы: 3.12 и 3.13), чтонаблюдаемое расщепление по мутации оранжевости возможно, если во всехмейозах идет тривалентная коньюгация трех хромосом I [MacMartin and James,1979]. Анеуплоидия ведет себя в мейозе как маркер, абсолютно сцепленный сцентромерой, так как расщепление по анеуплоидии определяется в I-ом делениимейоза, когда центромеры отходят к полюсам.
Таким образом, тетратип поанеуплоидиипоявляетсятольковрезультатекроссинговерамеждуанализируемым маркером и центромерой. В связи с этим, в тетрадном анализерасщеплениядиплоидов-трисомиковможнопроводитьнепосредственныеизмерения частот расщепления по этим генам в fII - во II-ом делении мейоза.
Этавеличина равна частоте тетратипов в сочетании исследуемого маркера ианеуплоидии (n+1) среди тетрад диплоида-трисомика (2n+1) [Горденин, 1978].152Таблица 3.12. Хроматидное расщепление у триплоида трисомика (++-)*Тип тетрад:1Расщепление в тетраде +++/+/**Тривалентная4/15**Бивалент-унивалент4/92+-/+/+8/154/93++-/+/+2/1504+/++/+1/151/9* по MacMartin, James, 1979;** Тип коньюгацииТаблица 3.13.
Расщепление по маркеру or13 у анеуплоида-трисомика похромосоме I хламидомонады (С1495)Тетрады:Тип Фенотип*Данныеэксперимента(С1495)11206643(Ho) Т.о. притривалентнойконьюгацииТ.о. прибивалент-унивалентконьюгации2з : 2з/н11,519,112з : 1з/н :1ор22,919,123з : 1ор5,7032з : 2ор2,94,84Всего тетрад:4343ВероятностьР (Ho) 0,95*Обозначения: з – зеленый; з/н - зеленый нестабильный; ор – оранжевыйВ потомстве С1495 (см. табл.3.11) расщепление по or3/n+1 было:6Р (2+ : 2-) : 11 N (4+: 0-) и 26 Т (3+:1-);тогда частота тетратипов f(T) составляет 26/43 = 0,6046; и расстояние генцентромер определяется как: Д =0,5f(T)x100 = 30,23 сантиморганов.Нестабильность анеуплоидов-дисомиков.
Нестабильность зеленых клоновпри вегетативном размножении выражается в появлении оранжевых и секторныхколоний в рассевах культур. Такие события у дисомиков генотипа: or13/or13+могут происходить за счет митотической рекомбинации, нерасхождения хроматидили в результате гемизиготизации штаммов. Оценка частоты мейотического153выщепления оранжевых клонов в потомстве зигот от скрещиваний анеуплоидовдисомиков на штаммы дикого типа и их митотической нестабильности какспонтанной, так и индуцированной УФ-излучением, позволила обнаружить(таблица 3.14) высокую частоту совместной сегрегации маркеров or13 и ery3 примитотической гомозиготизации дисомиков по хромосоме I, когда мутациинаходятсявцис-конфигурации.Крайнемалаявероятностьсвободнойрекомбинации этих маркеров (Р 0,001) позволяет говорить об их сцеплении.Мейотическое выщепление оранжевых сегрегантов определяли в потомстве(семейный анализ) зигот скрещиваний зеленых нестабильных сегрегантов наштамм дикого типа.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
