Диссертация (1144823), страница 31
Текст из файла (страница 31)
В овалах - мутации, исследуемые в настоящей работе171бесхлорофильногомутантаарабидопсиса,укоторогоинактивированыйинсерцией Т-ДНК ген Ch42 (cs) оказался гомологичным (49%)гену bchIRhodobacter [Koncz et al., 1990]. У бесхлорофильного мутанта Antirrhinum majus(львиный зев), полученного в результате Tam3-транспозонного мутагенеза,блокированный ген olive кодировал большую субъединицу МХ bchH [Hudson etal.,1993].Фенотипбесхлорофильных,накапливающихППмутантовхламидомонады по гену CHL1 свидетельствовал, что этот ген также кодируетбольшую (H) субъединицу МХ. Его клонирование позволило бы найти первый«водорослевой» ген CHLH.
Описанию этой работы посвящен следующийподраздел (3.2) настоящей работы.Способность мутантов хламидомонады по гену CHL1 накапливатьхимически-чистыйпротопорфиринIX(ПП)выгодноотличаетихот«порфириновых» мутантов других микроорганизмов и делает перспективнойосновой для создания штаммов-продуцентов этого пигмента. В процессевышеописанныхэкспериментовбылразработанэкспресс-методпродуктивности мутантов по ПП, и получены штаммы-продуценты.оценкиАллельныемутанты по гену LTS3, выращенные в темноте, не имеют ХЛ и накапливают: ППи его магниевые производные (от Mg-ПП, до протохлорофиллида).
Приосвещении, синтез ХЛ в их клетках частично восстанавливается, - наличиехлорофиллида (ХЛД), свидетельствует о дестабилизации комплекса ферментов,синтезирующих ХЛ, поскольку в норме этот промежуточный продукт ненакапливается. В световых культурах мутантов Lts3 и Brc-1 содержание ХЛсходно с таковым у штамма дикого типа, выращенного в темноте, и составляетпримерно 50-60% от уровня его накопления в световой культуре штамма дикоготипа.
Содержание гема – второго конечного продукта биосинтетической цепи,начинающейся с ПП, в темновых культурах мутантов вдвое превышает уровеньего содержания у штамма дикого типа в сходных условиях выращивания, повидимому, за счет избыточного содержания его субстрата - ПП. Возможно, что172мутации lts3 и brc1 в гене LTS3 нарушают темновые реакции превращения ПП вХЛ.Клетки штаммов дикого типа C.
reinhardtii способны синтезировать ХЛфотототрофно (на свету) и в условиях гетеротрофного ростаформируянаагаризованнойсредеколониизеленого(в темноте),цвета.Мутации,нарушающие светонезависимый (темновой) синтез ХЛ ведут к появлениюбесхлорофильных в темноте клеток, формирующих колонии желтого (благодаряналичию каротиноидов) или оранжевого (в случае накопления помимокаротиноидов красных пигментов – протопорфиринов) цвета. При освещении онизеленеют. Такой фенотип демонстрируют штаммы, несущие мутантные аллелигена LTS3: lts3 и brc-1.
Подобный фенотип характерен и для хорошо известногокласса желтых в темноте (yellow) мутантов, у которых заблокирован процесстемнового синтеза хлорофиллида (ХЛД) из ПХЛД - протохлорофиллида [Ford etal., 1980; 1981]. Для ответа на вопрос, не относятся ли мутанты C. reinhardtii погену LTS3 к типу «yellow», был проведен сравнительный анализ пигментногосостава их клеток, наряду с yellow-мутантами генотипа: y-7 и y-7,pc-1 (табл.3.18).В результате, между ними были выявлены существенные различия.
Клеткижелтых мутантов (генотипаколичестваХЛиy-7) при росте в темноте содержат следовыенакапливаюттолькоодинегопредшественник–протохлорофиллид (ПХЛД), свидетельствуя о дисфункции темновой ПХЛДоксидоредуктазы (тПОР), - фермента, превращающего ПХЛД в ХЛД независимоот света. Мутация pc-1 блокирует светозависимую ПХЛД-оксидоредуктазу(сПОР), которая осуществляет фотоконверсию ПХЛД до ХЛД, а у двойногомутанта генотипа: y-7,pc-1 это превращение заблокировано как на свету, так и втемноте. Мутанты по гену LTS3 накапливают более ранний, чем ПХЛДпредшественник ХЛ – протопорфирин IX, и, по-видимому, нарушение темновогобиосинтеза у них имеет иную, нежели у yellow-мутантов, генетическую основу.Данные биохимических исследований не позволили определить функциипродукта гена LTS3.
Они показали, что мутационные нарушения этого гена173блокируют в темноте конверсию ПП и ведут к дестабилизации работы ферментовранних его этапов (от ПП до ПХЛД). Таким образом, ген LTS3 C. reinhardtiiконтролирует темновой биосинтез ХЛ на этапе, предшествующем конверсииПХЛД. Это означало, что редукция ПХЛД – не единственный процесс в цепибиосинтезаХЛ,осуществляемыйдвумяпутями:светонезависимоисветонезависимо. Ко времени начала работы не существовало никаких данных огенетическом контроле темнового синтеза ХЛ кроме информации о генах,ответственных за превращение ПХЛД.
В этом отношении ген LTS3 оказалсяуникальным, и анализ мутантов по этому гену, его идентификация иклонирование обещали понять неизвестные к тому времени механизмы наиболеедревнего в эволюционном отношении темнового биосинтеза ХЛ у C. reinhardtii.3.1.5. Выводы1. Установлено, что у зеленой водоросли C. reinhardtii, рецессивныемутации, которые блокируют биосинтез ХЛ, приводя к накоплению егоинтермедиатов – порфиринов, принадлежат двум генетическим локусам CHL1 иLTS3, представленным рядом аллелей: chl1, brs-1, or3, or2/5, or5, lts7 и lts3-122,brc-1, or13, or69, соответственно.2. Гибридологический анализ, проведенный как на диплоидном, так и наполиплоидном (триплоидном) уровнях, показал отсутствие сцепления мутаций вгене LTS3 с маркерами VI, X, XI групп сцепления, позволил оценить расстояниеген-центромер в 30 сМ, и локализовать его в группе сцепления I.
Для гена CHL1расстояние ген-центромер определено как 5-8,7 сМ, и показано отсутствиесцепления с маркерами I, IV, X и XI хромосом.3. Анализ митотической рекомбинации гетерозигот по мутации or13 вгене LTS3 обрнаружил высокую частоту совместной сегрегации этой мутации имаркера ery3 хромосомы I, что позволило предположить тесное сцепление этихмутаций, и подтвердить локализацию гена в хромосоме I.1744. Биохимические исследования показали, что мутационные нарушениягенов CHL1 и LTS3 хламидомонады ведут к генетическому блокированиюбиосинтеза ХЛ на стадии конверсии протопорфирина IX(ПП) в магний-ППферментом магний-хелатаза.5.СветочувствительныемутантыпогенуCHL1вусловияхгетеротрофного роста не синтезируют хлорофилл и накапливают егоинтермедиат – протопорфирин IX.
В их клетках фермент магний-хелатаза неактивен и не детектируется белок, гомологичный белкам большой (H)субъединицы магний-хелатазы арабидопсиса и табака. У мутантов по гену LTS3блокированы темновые реакции синтеза ХЛ.1753.2. Идентификация гена CHLH С. reinhardtii, кодирующего большуюсубъединицу магний-хелатазыВ цепи биосинтеза тетрапирролов последним общим предшественникомхлорофиллов (ХЛ) и гема является протопорфирин IX (ПП).
Далее, взависимости от того, с ионом какого металла: железа (Fe2+) или магния(Mg2+) связываются молекулы ПП, запускаются, соответственно, ветви,ведущие к образованию гема или ХЛ. Магний хелатаза (МХ) осуществляетпервый специфический шаг пути биосинтеза ХЛ - встраивает магний вмолекулу ПП с образованием Mg-ПП. Фермент представляет собой белковыйкомплекс, состоящий из 3-х субъединиц: H, I, и D, размер которых, составляетпримерно 140, 40 и 70 kDa, соответственно.
Гены, кодирующие эти белки, убольшинствасинтезирующиххлорофилл/бактериохлорофиллорганизмов,обозначают: CHLH/BchH, CHLI/BchI и CHLD/BchD. Исключением из этогоправила стал ячмень, - субъединицы его МХ кодируются генами: Xantha-f,Xantha-h, Xantha-G, а их белковые продукты обозначаются как: XAN-F, XAN-H,XAN-G. Детальная картина функционирования МХ описана в разделе «Обзорлитературы».Настоящаяглавапосвященамолекулярно-генетическимисследованиям гена, кодирующего большую (H) субъединицу магний-хелатазы уодноклеточной зеленой водоросли C. reinhardtii.Культуры бесхлорофильных мутантов C.
reinhardtii по ядерному генуCHL1 светочувствительны, а в гетеротрофных условиях роста формируютна твердой агаризированной среде желто-оранжевые колонии (рисунок 3.10).Анализ пигментного состава клеток аллельных мутантов chl1 и brs-1 поэтому гену показал, что они накапливают только один интермедиатабиосинтеза ХЛ – протопорфирин IX – субстрат МХ (3.1.2). Резко сниженнаяактивность этого фермента у мутантов указывала, что продукт гена CHL1необходим для функционирования МХ, и, возможно, является одной из 3-х eѐ176Рисунок 3.10. Фенотип мутантов по гену CHL1.
Культуры штаммовдикого типа - СС124 и 137(+) C. reinhardtii и мутантов по гену CHL1(chl1 и brs-1) растущие на агаризованной среде ТАР в темноте (dark) и насвету (light) в течение пяти дней.субъединиц. Предварительные эксперименты по Western blot анализу белков,экстрагированных их клеток мутантов по гену CHL1 и штаммов дикого типа,c гетерологичными антителами для субъединиц МХ табака и арабидопсиса,свидетельствовали, что у мутантов отсутствует белок большой (H)субъединицы МХ (3.1.3). Поняв, что ген CHL1, по-видимому, кодирует этусубъединицу, мы приступили к его идентификации. Молекулярно-генетическиеподходы позволили клонировать ген большой (H) субъединицы МХ, который, всоответствии с общепринятой номенклатурой, получил название CHLH(вместо CHL1), и определить его интрон-экзонную структуру.
Секвенированиемутантных аллелей показало, что мутации chl1 и brs-1 являются вставками(+1) в экзонах 9 и 10 гена CHLH, соответственно [Chekunova et al., 2001].Работы по клонированию этого гена выполнялись на базе лаборатории проф.Бека в Германии (Beck Ch., Freiburg University, Germany) при поддержкенемецких фондов фундаментальных исследований DFG и DAAD.1773.2.1. Клонирование гена CHLH. Выбор стратегии и результатыГенетико-биохимические исследования мутантов по гену CHL1 C.
reinhardtiiпозволили с высокой степенью вероятности установить, что его продукт большая(H)субъединицамагний-хелатазы(МХ)–фермента,осуществляющего превращение протопорфирина IX в магний-протопорфиринIX в процессе биосинтеза ХЛ. Для решения задачи идентификации этого гена,была выбрана стратегия, учитывающая имеющиеся в нашем распоряженииинформацию, методы и материалы (рисунок 3.11А, Б). В 1996 году, на моментначала работы, такие гены были идентифицированы у нескольких объектов:бактерий Rodobacter capsulatus (BchH) и Synechocystis PCC6803 (chlH), ячменя(ген Xantha-f) и львиного зева (ген Olive).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
