Диссертация (1144823), страница 35
Текст из файла (страница 35)
ИдентификацияGUN-локусов позволила установить, что большая субъединица CHLH МХ играетопределяющуюрольвфункционированиисигнальнойсистемымеждухлоропластом и ядром [Mochizuki et al., 2001]. Имеют ли мутанты C.reinhardtii погену CHLH, нарушения в сигнальной системе ретроградной регуляции(хлоропласт-ядро) выяснить еще предстоит.Копийность гена CHLH C.
reinhardtii. В последнее десятилетие геномC.reinhardtii исследовался очень интенсивно [Grossman et al., 2003; Lohr et al.,2005]. Сиквенирование хлоропластного и митохондриального геномов былополностью завершено к концу 2007 года. Описание ее ядерного генома в рамкахгеномного проекта [Merchant et al., 2007] выдержало уже 5 версиий. Помимонуклеотидныхпоследовательностей,огромныйобъеминформацииотранскриптоме C. reinhardtii был получен при формировании библиотеки EST(expressionsequencetag),первоначально(www.kazusa.or.jp/en/plant/chlamy/est).Затем,созданнойамериканскийвЯпониинациональныйнаучный фонд NSF (National Science Foundation) профинансировала проект,реализация которого позволила не только получить более 200000 EST сиквенсов,но и осуществить их сравнительный анализ.
В ходе этой работы было обнаруженоболее10000уникальныхкДНК(www.biology.duke.edu/chlamy_genome).Microarrays для всех плаcтидных генов и около 3000 генов ядра могут бытьиспользованы для изучения генной экспрессии. Более того, существуетбиблиотека BAC-клонов, большинство из которых, удалось совместить сгенетической картой объекта. Наибольшее количество генетической информациио хламидомонаде собрано на геномном портале Института геномов (JGI, JointGenomeInstitute).Порциигеномныхсиквенсов,которыеудалосьреконструировать из перекрывающихся концов отдельных геномных ―shotgun‖197клонов, носят название досок (scaffolds) и являются основной формой подачигеномнойинформации.Сейчаснасчитываетсяболее300скаффолдов,пронумерованных по размерам – от самого крупного до самого короткого. Послеокончания работы в рамках геномного проекта каждая из 17 хромосомхламидомонады должна быть представлена в виде отдельной последовательности.Удобная программа просмотра (Genome Viewer) позволяет увидеть не толькопоследовательности нуклеотидов в отдельных хромосомах, но и получатьинформацию (как в графическом виде, так и в виде последовательностей) омногих известных и «предсказанных» генах, их интрон-экзонной структуре ипредполагаемых функциях.
Осуществляется «привязка отдельных BAC и ESTклонов к геномным последовательностям C. reinhardtii. Таким образом,созданныеинформациикнастоящемупозволяютвременибогатыеосуществлятьсетевыекомпьютерныйресурсыгеномнойанализгеномахламидомонады, получая ответы на вопросы, которые ранее требовалиэкспериментального подтверждения. К ним относятся и вопросы о ―копийности‖гена интереса.
Некоторое время назад был описан ген–паралог CHLH [Lohr et al.,2005], однако не было найдено его транскриптов. Наша экспериментальная работа– Саузерн-блот гибридизация геномной ДНК (рис. 3.13) - позволила сделатьвывод о существовании одной копии гена CHLH в геноме хламидомонады. Егопаралогов мы не нашли и при использовании компьютернойпрограммыBLASTII, тем самым подтвердив правильность полученных результатов.1983.2.8. Выводы1. Осуществлено клонирование гена CHLH хламидомонады, кодирующегобольшую H субъединицу магний-хелатазы – первого специфического ферментабиосинтеза хлорофилла.
С использованием широкого спектра молекулярногенетических методов (ПЦР, скринирование кДНК и геномных библиотек, RACEсистему обнаружения концевых участков кДНК и др.), получена полнаянуклеотидную последовательность этого гена и определена его интрон-экзоннаяструктура. Ген CHLH содержит 12 экзонов и 11 интронов. Его нуклеотиднаяпоследовательность включает промоторную область (180 пн), кДНК размером5049 пн, содержит короткий (25 пн) 5’UTR, ОРС длиной 4186 пн, кодирующую1399 аминокислотных остатков, и длинный (827 пн) 3’- UTR.2. Секвенирование мутантных аллелей гена CHLH показало, что мутацииchl1 и brs-1 являются вставками (+1) в экзонах 9 и 10, соответственно.
Мутациивызывают сдвиг рамок считывания и, при трансляции мутантных мРНК,появляютсякороткиенефункциональныепептидыдлиной457и559аминокислотных остатков, соответственно.3. Ген CHLH уникален – в геноме C. reinhardtii не обнаружено егопаралогов. Филогенетический анализ кодируемого им белка показал, что общимпредшественником для всех известных у про- и эукариот ортологов белка CHLHявляется CobN – кобальт-хелатаза прокариот.4. Наиболее функционально-значимым является С-концевой участок белкаCHLH.
Высказано предположение, что Mg2+ связывается с H-субъединицей черезостатки гистидина: H664, H668 и H813, формируя комплексы: гистидин-Mg2+протопорфирин IX. Связывание с субстратом – протопорфирином IX , повидимому, происходит за счет трех остатков цистеина: С784, С963 и С1104.1993.3. Идентификация гена LTS3 зеленой водоросли C. reinhardtiiГенетическийконтрольсветонезависимыхпроцессовформированияпигментов в растительной клетке изучали на модели мутантов по гену LTS3одноклеточной зеленой водоросли C.
reinhardtii, у которых темновой биосинтезхлорофилла нарушен на этапе, предшествующем конверсии протохлорофиллида вхлорофиллид. В условиях гетеротрофного роста эти мутанты не синтезируютхлорофилл и накапливают протопорфирины, а при переносе на свет – зеленеют.Фенотипическое проявление мутаций в гене LTS3 изучено на уровне пигментногосостава, активности ферментов биосинтеза хлорофилла и экспрессии генов,кодирующих эти ферменты. Осуществлено позиционное клонирование гена LTS3,и установлено, что он кодирует фактор транскрипции семейства ZnF_GATA,который в темноте активирует экспрессию генов ферментов биосинтезахлорофилла: магний-хелатазу и глутамат-полуальдегидаминотрансферазу, и, повидимому,необходимдляадаптациифотосинтезирующейклеткикфототрофным условиям [Чекунова и Савельева, 2010].3.3.1.
ВведениеРастения и фототрофные микроорганизмы могут синтезировать хлорофилл(ХЛ) двумя путями – на свету и в темноте. Известно, что эту способностьопределяютдвеферментныесистемы,катализирующиепревращениепротохлорофиллида (ПХЛД) в хлорофиллид (ХЛД) в процессе биосинтезапигмента [Forreiter, 1993 Reinbothe, 1996]. На свету превращене ПХЛДобеспечиваетфотоферментНАДФH:ПХЛД-оксидоредуктаза(сПОР),кодируемый ядром. Темновой синтез ХЛД из ПХЛД осуществляет ферментныйкомплекс тПОР, состоящий из трех полипептидов, кодируемых хлоропластнымигенами: chlB, chlN, и chlL. Светозависимый и темновой биосинтезы ХЛсосуществуют у многих организмов, включая цианобактерии, водоросли иголосеменные [Armstrong, 1998].
Покрытосеменные растения не способнызеленеть в темноте в результате утраты тПОР, тогда как большинство групп200эубактерий(Eubacteriophyta)˗древнихфотосинтезирующихорганизмов,образуют хлорофилл исключительно светонезависимым путем.Одноклеточная зелѐная водоросль C. reinhardtii – уникальный модельныйобъект генетики фотосинтеза [Rochaix, 1995].
Еѐ клетки образуют ХЛ на свету и вгетеротрофных условиях, используя в качестве источника углерода ацетат натрия.Такая способность позволяет получать мутанты по обоим путям биосинтеза:темновому и, индуцируемому светом [Ford, 1981; Choquet, 1992].В течение последних 50 лет у зеленых водорослей Chlamydomonas, Chlorellaи Scenedesmus были изолированы и изучены десятки мутантов с нарушеннымсветонезависимымсинтезомХЛ–неспособныезеленетьвтемноте[Александрова, 1979; Квитко, 1983; Timko, 1998]. Все они могут быть отнесены кодному фенотипическому классу, называемому «yellow».
В темноте их клетки несинтезируют ХЛ, накапливают ПХЛД, и, благодаря присутствию каротиноидов,формируют колонии желтого цвета, зеленеющие на свету. У хламидомонадыизвестно 3 хлоропластных и более десятка ядерных генов, нарушения в которыхприводят к подобному фенотипу [Timko, 1998]. Хлоропластные гены: chlB, chlN,и chlL кодируют субъединицы фермента тПОР [Choquet, 1992], роль же ядерныхгенов yellow до сих пор остается предметом дискуссий. Полагают, что оникодируют белки, регулирующие темновую редукцию ПХЛД [Cahoon and Timko,2000].Среди штаммов, зеленеющих на свету, но неспособных синтезировать ХЛ втемноте, у C.reinhadtii наряду с ―yellow‖ были описаны мутанты, клетки которыхв темноте накапливают более ранние, чем ПХЛД, красные предшественникихлорофилла – протопорфирины (ПП) и формируют колонии оранжевого цвета(рис. 3.9).
Сравнительно-генетический анализ таких фенотипически-сходныхмутантов (бесхлорофильные, накапливающие ПП в темноте, зеленеющие насвету) из Петергофской генетической коллекции [Cтолбова, 1971; Квитко, 1983]показал, что их фенотип обусловлен мутациями в одном ядерном гене, названномLTS3 [Чекунова, 1986]. Подобные мутанты: brc-1 и brc-2 были описаны в США201Энди Вангом [Wang, 1974] как штаммы, несущие рецессивные, аллельныемутации, которые генетически и функционально отличаются от мутации y-1,блокирующей темновое превращение ПХЛД. Поскольку двойной мутантгенотипа: brc-1,y-1 имел фенотип штамма brc-1, автор предположил, что локус«Brc» контролирует более ранний, чем конверсия ПХЛД, шаг биосинтетическогопути [Wang, 1974].
Сходные результаты были получены и в России при анализевзаимодействия мутаций lts3 и y-1, а в результате функционального ирекомбинационного тестов была установлена аллельность мутаций lts3 и brc-1[Чекунова, 1990; Шалыго, 1990]. Таким образом, генетический анализ позволилобнаружить у C.reinhadtii ген LTS3, контролирующий темновой биосинтез ХЛ наэтапе, предшествующем конверсии протохлорофилида в хлорофиллид (подраздел3.1).Существование накапливающих протопорфирины мутантов, способныхзеленеть в условиях фотоавтотрофного роста, свидетельствует, что редукцияПХЛД – не единственный шаг в цепи биосинтеза ХЛ, реализация которогозависит от света. Ген LTS3 уникален, и изучение мутантов по этому гену, егоидентификация и клонирование открывают возможность понять неизвестные кнастоящемувременигенетическиемеханизмынаиболеедревнеговэволюционном отношении темнового синтеза ХЛ.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
