Диссертация (1144823), страница 39
Текст из файла (страница 39)
При использовании праймеров,одинизкоторыхсоответствовалначалукДНКгена(поданныммоделирования), а второй – его поли-А концу, был получен ДНК фрагмент,217размер которого соответствовал ожидаемому размеру транскрипта гена LTS3(рисунок 3.27).Результаты изучения экспрессии методом ОТ-ПЦР(рисунок 3.28) свидетельствуют, что в норме,транскрипция гена LTS3 негативно регулируетсясветом. В клетках штамма дикого типаLTS3-транскриптовРисунок 3.27. кДНКгена LTS3; М – маркерпадалпослеуровеньосвещениятемновых культур и хорошо детектировался вклетках, выращенных на постоянном свету.
Вусловиях фототрофного роста (свет, отсутствие источника углерода ацетата) экспрессия гена LTS3 снижалась (рисунок 3.28). Уровень экспрессииLTS3 у мутанта brc1 снижен как при выращивании их клеток в темноте, так ина свету.Рисунок 3.28. Транскрипция гена LTS3 в клетках штамма дикого типа(wt), и мутанта brc-1, выращенных в темноте (Т), на свету (С) и последвух часов освещения (2ч) темновых культур. Контроль – экспрессиягена TUB2. 500 нг матричной кДНК использовали для ПЦРамплификации гена LTS3 с ген-специфичными праймерами: LTS-F2 gggcactttcatggctcgtg; LTS-R2 - cagcgtgctactggtgatg.Условия амплификации: 94 °C - 5 мин — 1-й цикл; 94 °C - 20 с, 63 °C 30 с, 72 °C – 40 с — 35 циклов; 72 °C 6 мин — последний цикл.Ампликоны (10 мкл) анализировали методом гель-электрофореза в 1,2%агарозном геле в буфере TBE.2183.3.11. Филогения гена LTS3Поиск гомологов белка LTS3, среди имеющихся в настоящее время в базахданныхnr(Allnon-redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+PIR+PRF excluding environmental samples from WGSprojects) последовательностей аминокислот был проведен с использованиемпрограммы BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?).В результате этой работы удалось установить, что ортологи белка LTS3 (219белков) имеются только у эукариот.
Их гомология основана на сходствецинк-пальцевых ДНК-связывающих доменов GATA и позволяет отнестиизучаемый белок к семейству ZnF_GATA (рисунок 3.29). Среди объектов,протеом которых содержит подобные LTS3 белки, найдены зеленыеводоросли, грибы, зеленые мхи и высшие растения (рисунки: 3.29; 3.30).Около 30 таких белков обнаружено у грибов, а остальные принадлежатобъектам из царства Зелѐных растений (Viridiplantae).
У грибов, белкиRicinus_communis_GATA- -SKKSCTDCKTTETPLWRAGPAGPKSLCNACGIRYRKTKRDILSFHKPicea_sitchensis----VPRVCVDCKTTKTPLWRSGPQGPKSLCNACGIRYRKARRALSAFGNSorghum_bicolor- ---AVRRCTHCQIEKTPQWRAGPLGPKTLCNACGVRYKSGR-------Zea_mays----AVRRCTHCQIEKTPQWRAGPLGPKTLCNACGVRYKSGR-------Oryza_sativa_GATA1-TF ----TVRRCTHCQIEKTPQWRAGPLGPKTLCNACGVRYKSGR-------Nicotiana_tabacum_AGP1 ----TIRKCQHCEITKTPQWRAGPMGPKTLCNACGVRYKSGR-------Arabidopsis_thaliana_G-MGRKCQHCGAEKTPQWRAGPAGPKTLCNACGVRYKSGR-------Glycine_max-TRRCSHCLAQRAPQWRAGPLGPKTLCNACGVRYKSGR-------Medicago_truncatula_G--TRRCTHCLSQRTPQWRAGPLGPKTLCNACGVRYKSGR-------Populus_trichocarpaNGQQQPRRCTHCLAQRTPQWRAGPSGPKTLCNACGVRYKSGR-------Chlamydomonas_reinhardtii - NGHCCTQCGTQTTPVWRAGPHGPKTLCNACGVRYMKVA-------Phaeosphaeria_nodorum_ LKIADEYVCTDCGTLDSPEWRKGPNGPKTLCNACGLRWAKKE-------PhycomyceswctC---DEFVCADCGTTTSPEWRKGPHGPKTLCNACGLRWAKKN-------Arabidopsis_th.
GATA1 -VIRVCSDCNTTKTPLWRSGPRGPKSLCNACGIRQRKARRAAMAAAAOstreococcus lucimarinusCLHCGTVKTPQWRMGPEGKKTLCNACGVRYMK . .Рисунок 3.29. Множественный элаймент белка LTS3 C. reinhardtii (выделенголубым цветом). (CLUSTALWResult - http://align.genome.jp/sit-bin/clustalw).Зеленым выделены аминокислоты, формирующие ZnF_GATA –домен.ортологи LTS3 относятся к транскрипционным факторам, участвующим всветовой регуляции роста и развития этих организмов - WC1 (white collar) и219WC2, также называемых LreB [Idnurm .and Heitman, 2005]. Одиннадцатьподобных предсказанных белков были найдены у зеленых водорослей(Chlorophyta), способных как к фототрофному, так и к гетеротрофному типупитания: Volvox, Chlorella, у одноклеточных микроводорослей Micromonas иOstreococcusклассапразинофитов(Prasinophytes)-самыхмелкихпредставителей эукариот размером меньше микрона, населяющих океан с всоставе фитопланктона [Zubkov et al., 2007]. Остальные, – около 190 белков,подобных LTS3, обнаружены у представителей подцарства высших(зародышевых) растений (Embryophyta).
Десяток - у зеленогомхафискомитрелла отклоненная (Physcomitrella patens), который считаетсяпервым представителем царства зеленых растений, вышедшим на сушу. Вподавляющем большинстве (169 белков), они принадлежат семеннымрастениям (Spermatophyta), среди которых 168 - у покрытосеменных(Magnoliophyta) и один белок был идентифицирован у представителяголосеменных – ели Picea sitchensis. В геноме модельного объекта генетикирастений - арабидопсиса найдено 30 генов, кодирующих транскрипционныефакторы, имеющие домены ZnF_GATA [Manfield et al., 2007], среди которыхнаиболее близкими по структуре и функциям гену LTS3 являются гены:GATA-2, GNC (GATA-21) и CGA1 (GATA-22). Недавно установлено, чтофактор GATA-2 – позитивный регулятор фотоморфогенеза, являетсяключевым компонентом системы световой регуляции транскрипции геноврастения [Luo et al., 2010].
Он связывается с промоторами светозависимыхгенов, контролируя их активность в ответ на свет и брасиностероиды, ирегулируетактивностьсобственногогенапомеханизмуобратногоингибирования в темноте. Гены GNC [Bi et al, 2005] и CGA1 [Naito, et al.,2007] имеют сходные профили экспрессии, - они нитрат-индуцибельны,экспресируются только в зеленых фотосинтезирующих тканях (но не вкорнях), и их активность регулируется светом, циркадными ритмами ицитокининами. Мутации в гене GNC нарушают скотоморфогенез (развитие220растений в условиях гетеротрофного роста в темноте) снижают уровеньбиосинтеза хлорофилла и редуцируют экспрессию генов углеродногометаболизма [Manfield et al., 2007].Рисунок 3.30.
Филогения белка LTS3 (по результатам поиска гомологов,программа BLAST - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)В результате поиска парпалогов гена LTS3 (ID:171659, chr._1:36971303697600) в геноме C.reinhardtii удалось обнаружить еще 3 ОРС, кодирующихGATA- факторы (http://genome.jgi-psf.org/annotator/servlet/jgi.). В хромосоме 7(chromosome_7:1055038-1056306) - это ОРС, кодирующая белок ID:127044,на скаффолде 28 (scaffold_28:241075-243926) - ID:154888, и ген CPL2 вхромосоме10(chromosome_10:2370115-2372043),кодирующийбелокID:205871.
Выяснение их функций еще предстоит.3.3.12. Поиск GATA-мотивов в промоторных областях генов C.reinhardtii, кодирующих ферменты биосинтеза хлорофилловУстановление структуры белка LTS3 позволило отнести его к факторамтранскрипции, узнающих GATA-мотивы в промоторах светорегулируемых221генов и, тем самым, дало основание предположить механизм егофункционирования. Поскольку изучение экспрессии генов, кодирующихбиосинтез хлорофилла, показало, что LTS3 необходим для транскрипциигенов магний-хелатазы: CHLH, CHLI, CHLD и GSA в темноте и на раннихэтапах их световой активации, в промоторных областях этих генов былосуществленпоискцис-элементов,узнаваемыхДНК-связывающимидоменами (ZnF_GATA): GATA, TATC (комплементарный вариант – втораяцепь) и G-боксов (CACGTG) – последовательностей, существенных длясветовой регуляции транскрипции (таблица 3.29).
Анализ нуклеотиднойпоследовательности 5‘фланкирующих районов ДНК размером более 1тпнвыше по течению от точки начала транскрипции этих генов позволилустановить, что все они содержат GATA-элементы (от одного – у ALAD иCHL1, до пяти – у GSA). G-боксы найдены у трех из 7 анализируемых генов:GSA, CHLH и CHLD.Таблица 3.29. Цис-действующие элементы в 5’ нетранслируемыхрайонах генов, кодирующих ферменты биосинтеза хлорофилла у C.reinhardtiiГеныХ*.Положение нахромосомеНаличие элементов**:TATCGATAGTRGSA734045502-40487721302583-13060131 (-1047)2(-5; -390)3 (-1174; -888; +22)5 (1323; -854; -789;-490; -477)02 (-1331;-1192)ALADCHLHCHLDCHLI-1CHLI2CHLM275612122268307-22719031696490-17033562231874-22380157012904-70169783134690-31386451834748-183816804 (-1272; -1012; -818; -339)3 (-286;-276; -746)3 (-135; -956; -1265)2 (-973;-846;01 (-917)2(-1232; -715)2 (-761; +141)1 (-148)2 (-107; +99)101 (-195)2 (-216; -969)001G-box*Х – хромосома; ** цифры указывают на количество обнаруженных элементов, в скобках– положение первого нуклеотида элемента по отношению к точке начала транскрипции2223.3.13.
Обсуждение результатовВ настоящей главе описаны мутанты хламидомонады по гену LTS3,которые стали предметом изучения генетической детерминации механизмовтемнового биосинтеза хлорофиллов (ХЛ) - наименее изученной областиисследованийпроцессовхлорофиллобразования.Анализпигментногосостава показал, что мутации: lts3 и brc-1 в этом гене приводят к егоблокированию и накоплению интермедиата ранних этапов биосинтеза ХЛ протопорфирина IX (ПП) и в следовых количествах его магниевыхпроизводных. На свету, мутанты зеленеют и синтезируют ХЛ до уровня,характерного для клеток дикого типа, выращенных темноте.Свет в норме индуцирует ферменты биосинтеза ХЛ у высшихрастений, повышая их активность на 20-50% [Reinbothe, 1996].
Уровень ихактивности у организмов, способных к образованию хлорофиллов в темнотеи на свету, составляет ок. 60% и 40%, соответственно. Проверка функцийферментов: магний-хелатазы (МХ), магний-ПП-метилтрансферазы и АЛКсинтезирующего комплекса показала, что у мутантов C. reinhardtii по генуLTS3 в темноте резко снижены активности МХ и АЛК-синтезирующегокомплекса. Они составляют 22% и 7% от уровня световых культур штаммадикого типа. На свету происходит восстановление их активности до уровня,характерного для темновых культур дикого типа. Фермент магний-ППметилтрансфераза утратил способность к регуляции светом.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
