Диссертация (1144823), страница 42
Текст из файла (страница 42)
У мутантов по гену LTS3 в темноте подавлена транскрипция генов,кодирующих МХ и фермент GSA-АТ, из АЛК-синтезирующего комплекса.Синтез белков большой (H) и малой (I) субъединиц МХ у штамма дикоготипа и мутанта lts3 соответствует динамике накопления мРНКкодирующих их генов, означая, что регуляция их экспрессии происходит науровне транскрипции.5. По данным тетрадного анализа ген LTS3 картирован в хромосоме I233C. reinhardtii на расстоянии 0,34 сМ от маркера ac115, в 30 сМ отцентромеры.6. Осуществлено позиционное клонирование гена LTS3 и установленаего структура: ген содержит 2 экзона (58 пн и 257 пн) и 1 интрон (156 пн).Его транскрипт (815 пн) включает короткий (33 пн) 5’- нетранслируемыйрайон (5’UTR), открытую рамку считывания (315 пн), кодирующую белок из104 аминокислотных остатков, и длинный (467 пн) 3’UTR.
Ген LTS3локализованнахромосомеIC.reinhardtiiвположении:chromosome_1:3697097-3698067.7. Компьютерный анализ (http://expasy.org/tools/scanprosite) обнаружилв структуре виртуального белка, кодируемого геном LTS3, один ДНКсвязывающий домен со структурой «цинкового пальца», типичный длятранскрипционных факторов семейства GATA (ZnF_GATA).8. 5’-фланкирующиая последовательность гена LTS3 содержит цисдействующие элементы GATA и CRE (cAMP response element) ˗ палиндром:5’ TGACGTCT 3’, который участвует в регуляции экспрессии генов в ответна ограничения по источникам азота и углерода.
Наличие GATA-элементов впромоторной области гена LTS3 свидетельствует о его способность кавторегуляции, а мотив CRE – зависимости его экспрессии от источниковазота и углерода.9. Секвенирование мутантных аллелей гена LTS3 показало, чтомутация brc-1 является вставкой нуклеотида T в позиции 119+, а мутацияlts3 представляет собой делецию 2-х нуклеотидов в положении 160-163 накДНК гена LTS3. Обе мутации приводят к сдвигу рамки считывания исинтезу белков, не содержащих GATA-домен.10. Транскрипция гена LTS3 в норме негативно регулируется светом, ипозитивно – источником углерода ацетатом натрия. В клетках мутантаbrc-1 уровень экспрессии LTS3 значительно ниже нормы.11.
Поиск белков, гомологичных LTS3, в базах данных nr (All non-234redundant GenBank CDS translations) с использованием программы BLASTпоказал, что ортологи белка LTS3 (более 200), встречаютсятолько уэукариот. Их гомология основана на сходстве цинк-пальцевых ДНКсвязывающих GATA-доменов и позволяет отнести белок LTS3 к семействуфакторов транскрипции ZnF_GATA. В геноме C. reinhardtii обнаружено 3паралога гена LTS3, функции которых, выяснить еще предстоит.12. Нуклеотидные последовательности 5’фланкирующих районов(более 1тпн выше по течению от точки начала транскрипции) генов C.reinhardtii, кодирующих ферменты биосинтеза ХЛ, содержат GATAэлементы (от одного – у ALAD и CHL1, до пяти – у GSA).
G-боксы найдены утрех из 7 анализируемых генов: GSA, CHLH и CHLD. Наличие сайтовсвязывания с факторами транскрипции ZnF_GATA в промоторных областяхэтих генов подтверждает гипотезу об их регуляции фактором LTS3.2353.4. Супрессия мутаций в гене LTS3 C.
reinhardtiiСупрессия (лат. suppressio, от supprimo - задерживаю, подавляю) –генетическое явление, препятствующее проявлению у организмапризнака, возникшего в результате мутации; приводит к частичномуили полному восстановлению нормального фенотипа...Большая Советская ЭнциклопедияГенетическую детерминацию механизмов темнового биосинтезахлорофиллов (ХЛ) и его регуляции светом у модельного объекта генетикифотосинтеза – водоросли C. reinhardtii изучали на модели мутантов по генуLTS3, кодирующему фактор транскрипции семейства GATA. Предметисследования – бесхлорофилльные, накапливающие в темноте ПП, мутантыпо гену LTS3, их ревертанты и обратные мутанты.
В культуре клетокауксотрофного по аргинину мутанта по гену LTS3 генотипа: arg7,brc-1 былотобран зеленый в темноте спонтанный ревертант Brc-8. Причинойвосстановления темнового синтеза ХЛ у него стала рецессивная мутацияsup-3 в ядерном гене SUP-3, сцепленном с геном LTS3. Мутация sup-3 такжесупрессировала проявление другой мутантной аллели lts3 этого гена,демонстрируя отсутствие аллелоспецифичности [Савельева и Чекунова,2005]. В результате инсерционного мутагенеза зеленого в темнотеревертанта Brc-8 был получен обратный мутант Т8-3, у которогопроизошел возврат к фенотипу исходного оранжевого в темноте мутантаBrc-1. Ниже представлены результаты исследований полученных штаммов:ревертанта Brc-8 и трансформанта Т8-3 методами биохимии, генетики имолекулярнойбиологии.Идентифицированинсерцией в геноме штаммагенSUP-1,разрушенныйT8-3, продукт которого активируеттранскрипцию гена LTS3 и является элементом системы транскрипционнойрегуляции ядерных генов, контролирующих процессы темнового биосинтезахлорофилла у хламидомонады [Чекунова с соавт., 2014].2363.4.1.
Получение ревертанта Brc-8 и характеристика его фенотипаИсследования гена LTS3 С. reinhardtii позволили установить, чтокодируемый им белок является важным компонентом транскрипционныхкомплексов, регулирующих экспрессию фотозависимых генов ферментовбиосинтеза ХЛ: магний-хелатазу (МХ) и АЛК-синтезирующий комплекс(раздел 3.3). Для обнаружения других элементов этой системы была выбранастратегия, предусматривающая изучение ревертантов, полученные отмутантов по гену LTS3. Одним из подходов к поиску альтернативных путейбиосинтеза является изучение супрессии мутантных признаков. Длявыявления факторов, обеспечивающих синтез ХЛ у хламидомонады вусловиях отсутствия функционального белка LTS3, из клеточной культурыштамма, несущего мутацию brc-1 в гене LTS3 был отобран спонтанныйревертант Brc-8, способный синтезировать ХЛ в темноте (рисунок 3.31).Мутанты хламидомонады, несущие аллельные мутации: lts3 и brc-1 вгене LTS3, синтезируют ХЛ только на свету.
В темноте, в условияхгетеротрофного роста их клетки накапливают предшественники ХЛпротопорфирины и формируют желто-коричневые колонии. В культуререкомбинантного штамма генотипа: brc-1,arg-7,mt+, полученного в потомствескрещивания штаммов Brc-1 и Arg7, был отобран спонтанный ревертант Brc8, способный синтезировать хлорофилл и в темноте. В условиях постояннойосвещенности содержание ХЛ в клетках ревертанта Brc-8 и мутанта Brc-1практически одинаково и составляет примерно 60% от уровня штамма дикоготипа (таблица 3.30). При выращивании в темноте ревертант синтезировал тоже количество ХЛ, что и на свету, и не отличался по этому показателю отсветовых культур исходного мутанта Brc-1 и штамма дикого типа,выращенного в темноте.
Таким образом, темновой синтез ХЛ у ревертантаоказался восстановленным до уровня штамма дикого типа. По-видимому,супрессорный эффект касался прежде всего светонезависимого синтеза ХЛ, ине повлиял на его световую регуляцию – у обоих штаммов – мутанта Brc-1 и237Рисунок 3.31. Схема получения спонтанного ревертанта Brc-8. В потомствескрещивания оранжевого в темноте мутанта Brc-1(+) и аргинин-зависимогоштамма СF 32 (arg7-3,mt-) в гетеротрофных условиях был отобран оранжевыйаргинин-зависимый рекомбинант генотипа: brc-1, arg7-3.
Его клетки быливысеяны на свет на среду без ацетата (Т) в двух вариантах: с аргинином и без него.Зеленые колонии выросли только на среде с аргинином, свидетельствуя, чтоисходный рекомбинант ауксотрофен по аргинину и способен к фотоавтотрофномуросту (на среде без источника углерода – ацетата натрия). Зеленые фототрофныеколонии далее были распечатаны на среду с ацетатом и аргинином и помещены втемноту. Среди выросших в гетеротрофных условиях оранжевых клонов былотобран зеленый ауксотроф Brc-8, который стал предметом изученияТаблица 3.30. Содержание хлорофиллов (ХЛ) в клетках мутантов по генуLTS3ШтаммФенотипГенотипСС124Lts3зеленыйоранжевый втемноте, на светузеленеющийзеленый,аргининзависимыйwtlts3Brc-1Brc-8ХЛ (моль/109 клеток)СветТемнота3,22,482,210,09brc-12,420,08brc-1,arg7,sup-32,512,32238его ревертанта Brc-8, практически отсутствует активация светом процессахлорофиллобразования.3.4.2.
Гибридологический анализ ревертанта Brc-8Для ответа на вопрос, является ли восстановление темнового синтезаХЛ у штамма Brc-8 модификацией, или наследуемым свойством, былосуществлен его гибридологический анализ. В тетрадах мейотическогопотомстваскрещиванияштаммаBrc-8иисходногомутантаBrc-1расщепление по окраске колоний в темноте было моногенным (2 зеленых : 2оранжевых). Это означало, что признак наследуется, и реверсия произошла врезультате единичной ядерной мутации. Способность синтезировать ХЛ втемноте у ревертанта Brc-8 могла появиться или в случае обратной мутации вгене LTS3, либо, с большей вероятностью, в результате мутации другого гена,супрессирующей мутантную аллель brc-1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
