Диссертация (1144823), страница 45
Текст из файла (страница 45)
Экспрессиягена AMY-1, регулируется фактором транскрипции семейства GATA [Furusawaet al., 2003]. Исходя из имеющейся информации, трудно предположитьфункции продукта гена SUP-1. Сравнение фенотипов ревертанта Brc-8 итрансформанта Т8-3, полученного на его основе, свидетельствует, что оннеобходим для реализации механизма супрессии мутантной аллели генаLTS3. Для ответа на вопрос, влияет ли белок SUP-1 на транскрипцию генаLTS3, был проведен анализ экспрессии этого гена у трансформанта Т8-3.3.4.9. Экспресия гена LTS3 в клетках инсерционного мутанта Т8-3Транскрипцию гена LTS3 в различных условиях освещения (рисунок 3.37)изучали методом ОТ-ПЦР у штамма дикого типа СС124, мутанта Brc-1 погену LTS3 (генотипа brc-1), его ревертанта Brc-8 (генотипа brc-1,sup3), итрансформанта T8-3 (генотипа brc-1,sup3,Sup-I).
В клетках штамма дикоготипа, свет подавлял экспрессию гена LTS3, - уровень его транскриптов падалпосле освещения темновых культур и хорошо детектировался в клетках,выращенных на постоянном свету. Наличие ацетата в среде вело к усилениюего транскрипции. Экспрессии гена LTS3 у мутанта Brc-1 ниже, чем уштамма дикого типа и его ревертанта Brc-8. У трансформанта Т8-3 в темнотеи при его двухчасовой экспозиции на свету LTS3-транскрипты недетектировались. Более продолжительное освещение приводило к гибеликлеток, что указывало на их светочувствительность.253Рисунок 3.37. Экспрессия гена LTS3 в клетках штаммов С.
reinhardtii: Brc-8,Т8-3, CC124 (wt) и Brc-1, выращенных в темноте (Т), после их освещения втечение 2 часов, и на свету (С). Контроль – экспрессия гена Tub2. ТотальнуюРНК из клеток обрабатывали ДНК-зой и проводили обратную транскрипциюферментом M-MLV (РНК-зависимой ДНК-полимеразой) с праймерами oligo-dT.Полученные кДНК (500 нг) служили матрицами для ПЦР-амплификации генаLTS3 с праймерами: LTS-F2 - ggg cac ttt cat ggc tcg tg; LTS-R2 - cag cgt gct act ggtgat g . Условия амплификации: 94 °C - 5 мин — 1_й цикл; 94 °C - 20 с, 63 °C - 30 с,72 °C – 40 с — 35 циклов; 72 °C 6 мин — последний цикл.
Ампликоны (10 мкл)визуализировали гель-электрофорезом в 1,2% агарозном геле в буфере TBЕ.3.4.10. Активность магний-хелатазы в клетках штаммов Brc-8 и Т8-3Мутации в гене LTS3 приводят к неспособности мутантных клеток втемнотесинтезироватьХЛинакоплениюегоинтермедиата–протопорфирина IX (ПП) - субстрата фермента магний-хелатазы (МХ).Причиной такого фенотипа явилось резкое снижение активности этогоключевогоферментабиосинтезаХЛ.Дляответанавопрос,какфункционирует МХ в клетках анализируемых мутантов, была осуществленаоценка активности этого фермента в культурах исходного мутанта Brc-1,спонтанного ревертанта Brc-8 генотипа:brc-1,sup-3 и обратного мутанта Т8-3генотипа: brc-1, sup-3, sup-I (рисунок 3.38).
В клетках штамма Brc-1 отмеченнизкий уровень темновой активности МХ. У ревертанта он оказался резкоповышен (в 6,8 раза) по сравнению с исходным мутантом и практическивдвое (1,9 раза) по сравнению со штаммом дикого типа, растущего в темноте.Высокий уровень активности МХ сохранялся и у трансформанта T8-3.Световые культуры мутанта Brc-1 и ревертанта имели сходный уровень254активности этого фермента. Полученные результаты свидетельствуют, что узеленого ревертанта Brc-8 в темноте резко повышен (по сравнению сисходным мутантом brc-1 и штаммом дикого типа) уровень активности МХ,который сохраняется у обратного мутанта Т8-3.Рисунок 3.38. Активность магний-хелатазы в клетках исследуемых штаммов.Культуры штамма дикого типа СС124 и мутантов по гену LTS3 выращивали вусловиях темноты (Т) или на постоянном свету (С)3.4.11.
Обсуждение результатовБиосинтез функциональных тетрапирролов в фотосинтезирующейклетке начинается с образования из глутамата 5-аминолевулиновой кислоты(АЛК), которая через серию энзиматических реакций превращается впротопорфирин IX (ПП) – общий предшественник гема и ХЛ. Первыйспецифический фермент биосинтеза ХЛ – магний-хелатаза (МХ) –обеспечивает превращение ПП в магний-протопорфирин IX (Mg-ПП), ипредставляет собой комплекс, состоящий из трех субъединиц: CHLI, CHLD иCHLH. Метилирование Mg-ПП и формирование циклопентанонового кольцазавершаются последовательным образованием протохлорофиллида (ПХЛД),хлорофиллида (ХЛД) и ХЛ. До недавнего времени полагали, что способностьрастений и фототрофных микроорганизмов синтезировать ХЛ на свету и в255темнотезависиттолькоотналичиядвухферментныхсистем,обеспечивающих превращение протохлорофиллида (ПХЛД) в хлорофиллид(ХЛД).СветозависимыйкатализосуществляетНАДФН:ПХЛД-оксидоредуктаза (сПОР), находящаяся под контролем ядерного генома.Темновую реакцию катализирует ферментный комплекс тПОР, субъединицыкоторого кодируют 3 гена хлоропласта: chlB,chlN и chlL, ведущие своепроисхождение от нитрогеназ эубактерий.
В процессе эволюции высшиерастения утратили тПОР, а более древние фотосинтетики, к числу которыхпринадлежитодноклеточнаязеленаяводоросльChlamydomonas(C.)reinhardti – модельный объект генетики фотосинтеза [Rochaix, 1995],сохранили способность синтезировать ХЛ в темноте, используя в качествеисточника углерода ацетат натрия. Таким образом, независимое от светавосстановление ПД у хламидомонады осуществляют продукты треххлоропластных генов, кодирующих тПОР, и не менее восьми ядерных генов,функции которых до сих пор не ясны [Ford, 1981; Zhang, 2007].
Мутации вэтих генах блокируют способность синтезировать ХЛ в темноте иобусловливают ―yellow‖ фенотип, - бесхлорофилльные клетки водоросли,подобно этиолированным проросткам высших растений накапливают ПД, и,благодаря каротиноидам, формируют желтые колонии, зеленеющие на свету.Клетки C. reinhardtii, несущие аллельные мутации (brc-1 и lts3) в генеLTS3в темноте накапливают более ранние, чем ПХЛД, красныепредшественники ХЛ – ПП и Mg-ПП, и формируют колонии оранжевогоцвета,носпособнызеленетьнасвету.Фенотипlts3-мутантовсвидетельствовал о наличии независимого от ПХЛД контроля темновогобиосинтеза ХЛ. Молекулярная идентификация и анализ структуры гена LTS3показали, что он кодирует ДНК-связывающий белок семейства GATA,позволив предположить, что белок LTS3 является фактором транскрипции,активирующимэкспрессиюгеновмагний-хелатазывгетеротрофныхусловиях роста (раздел 3.3).
Это означало, что у C. reinhardtii регуляция256темнового биосинтеза Хл осуществляется не только на этапе превращенияПХЛД, но и на более ранней стадии синтеза пигмента – путемтранскрипционной регуляции генов магний-хелатазы.С целью исследования новых, еще неизвестных молекулярногенетических механизмов регуляции темновых процессов биосинтеза ХЛ у C.reinhardtiiизучалисупрессиюмутантныхпризнаковуспонтанногоревертанта и обратного мутанта, полученных от пигментных мутантов погену LTS3.
Из клеточной культуры бесхлорофилльного мутанта по гену LTS3был отобран зеленый в темноте спонтанный ревертант Brc-8. По содержаниюХЛ его клетки практически не отличались от клеток дикого типа,выращенныхвтемноте(таблица3.36).По-видимому,супрессиякомпенсировала потерю функций фактора LTS3. Она восстанавливалатемновой биосинтез ХЛ, не влияя на его световую регуляцию – у ревертантаBrc-8практическихлорофиллобразования.отсутствовалаПричинойактивацияспособностисветомпроцессасинтезироватьХЛуревертанта Brc-8 стало резкое повышение активности МХ в темноте (рис.3.38). Она семикратно превышала активность этого фермента у исходногомутанта brc-1 и оказалась вдвое выше таковой у штамма дикого типа.
Насвету активность МХ у ревертанта снижалась, означая, что дополнительныйпуть темновой регуляции биосинтеза ХЛ репрессируемый в норме факторомSUP3, негативно регулировался светом.Генетический анализ выявил мутационную природу супрессии – способностьсинтезировать ХЛ у ревертанта восстановилась в результате мутации вядерном гене SUP-3, сцепленном с геном LTS3 в хромосоме 1 C. reinhardtii.Наличиемежгеннойсупрессиисвидетельствовалоовключенииальтернативного механизма регуляции. По-видимому, фактор SUP-3 в нормерепрессирует синтез ХЛ в темноте, а мутация sup-3 блокирует эту функцию.Поскольку, по нашим данным, белок LTS3 является транскрипционнымактиватором генов магний-хелатазы, мы предположили, что в случае его257дисфункции в клетках водоросливключается альтернативный механизмтемновой активации экспрессии этих генов, в норме, находящийся поднегативным контролем белка SUP-3.
Репрессирующая активность SUP-3чрезвычайно велика, - мутация в гене SUP3 вела к двухкратному повышениюактивности МХ в темноте даже по сравнению с диким типом.Для обнаружения дополнительных факторов активации синтеза ХЛ втемноте на основе зеленого ревертанта Brc-8 был получен мутант Т8-3, укоторого инсерция привела к возврату фенотипа исходного мутанта Brc-1.Генетический анализ и изучение пигментного состава клеток Т8-3 позволилиидентифицировать его генотип: brc-1,sup-3,sup-I, подтвердив, что оранжевыйв темноте фенотип клеток T8-3 обязан мутации brc-1 в гене LTS3. Высокийуровень активность МХ, выявленный у трансформанта, сопоставимый стаковым у ревертанта Brc-8, указал, что эффект мутации sup-3 сохранен в егоклетках, но, при этом, инсерция заблокировала способность к зеленению.Локализация инсерции в хромосоме 13 ядерного генома C. reinhardtiiпозволила найти ген, названный SUP-1, экспрессия которого была нарушенавставкой.
Методами биоинформатики не удалось установить функциикодируемого им белка, состоящего из 108 аминокислотных остатков.Наличие сайта фосфориллирования протеинкиназой С (PKC) в его структуресвидетельствовало, что SUP-I является элементом системы регуляциипроцессов биосинтеза ХЛ у C. reinhardtii. Его отсутствие у мутанта Т8-3ведет к снижению транскрипции гена LTS3 (рисунок 3.37) и потереспособности зеленеть на свету.
Взаимодействие генов LTS3 и SUP-I былоустановленовкомплементационномтесте.Оказалось,чтоэффектпроявления инсерционной мутации (доминантный или рецессивный) зависелот контекста, – наличие в клетке нормально функционирующего продуктагенаLTS3менялохарактервзаимодействияаллелейгена-мишени.Доминантный эффект мутантной аллели Sup-I на фоне гомозиготы помутациям в гене LTS3, свидетельствует, что оба белка – LTS3 и SUP-I258взаимодействуют, и фактор транскрипции LTS3 необходим для реализациифункции фактора SUP-I.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
