Диссертация (1144823), страница 49
Текст из файла (страница 49)
Тот же эффект наблюдали при освещении растенийдикого типа, обработанных норфлюразоном (НФ) - ингибитором биосинтезакаротиноидов [Taylor, 1989] или антибиотиком линкомицином, которыйподавляет трансляцию в хлоропластах [Ruckle et. al., 2007].Факты подавления экспрессии ядерных генов биосинтеза ХЛ в ответна блокирование функций хлоропластов объясняли существованиемпластидных факторов - сигнальных молекул, которые продуцируетхлоропласт для регуляции (позитивно или негативно) транскрипцииядерных генов [Batschauer et.
al., 1989]. В роли «пластидного фактора»могут выступать предшественники ХЛ. Впервые эта гипотеза была276проверены при сравнительном изучении экспрессии гена CAB1 убесхлорофильных мутантов зеленой водоросли хламидомонады: brs1, brc1 иy-1, накапливающих интермедиаты биосинтеза ХЛ: протопорфирин IX(ПП), Mg-ПП и ПХЛД, соответственно [Johanningmeier and Howell, 1984]. Вэкспериментах также использовали штаммы дикого типа, которые послеобработки ингибиторами: левулиновой кислотой и α,α-дипиридиломнакапливали, соответственно, аминолевулиновую кислоту (АЛК) и Mg-ППмонометиловыйэфир(Mg-ППМЭ).Результатыэкспериментовдемонстрировали, что избыточное содержание только одного интермедиата- Mg-ПП вело к ингибированию световой индукции экспрессии гена CAB1.Мутанты хламидомонады brs1 и brc1 также были использованы вэкспериментах Я.
Кропат при изучении влияния ПП и Mg-ПП наэкспрессию генов белков теплового шока: HSP70A и HSP70B [Kropat et. al.,1997].Вработебылопоказано,чтоэкзогенныйППподавляетиндуцированную светом транскрипцию этих генов, а накопление Mg-ПП втемноте напротив, стимулировало (подобно свету) их экспрессию.УрастенийиводорослейбиосинтезХЛосуществляетсявхлоропласте, а большинство энзимов, вовлеченных в этот процесс,кодируются ядром и синтезируются в цитоплазме. Для оптимизации этогопроцесса необходим строго координированный контроль уровня экспрессииядерных генов в ответ на метаболические сигналы и факторы внешнейсреды. Механизмы взаимодействия геномов ядра и хлоропласта изучали намутантах арабидопсиса по ретроградному контролю, названых gun(1-5)(genomes uncoupled) [Susec et.
al., 1993]. У этих мутантов транскрипцияядерных генов, кодирующих белки хлоропласта: CAB и RBCS, сохраняется(в отличие от нормальных растений) в условиях фотодеструкциихлоропластов – при освещении обработанных НФ проростков. Гены,затронутые gun-мутациями, кодируют белки, участвующие в биосинтезететрапирролов. Мутация gun5 представляет собой замену нуклеотидов (С-Т)277в гене CHLH большой (H) субъединицы МХ которая ведет к заменеаминокислот А990V в белке CHLH [Mochizuki et al., 2001]. Продукт генаGUN4 оказался способен in vitro связывать ПП и стимулировать активностьМХ, а в структуре белка GUN4 был обнаружен специфический сайтсвязывания и молекул Mg-ПП [Adhikari et al., 2011].
В экспериментах поизучению теновой экспрессии генов CABII, HSP70A, также как и CHLH иGTR, кодирующих компоненты комплексов МХ и синтеза АЛК выяснилось,что мутация brs-1 C. reinhardtii, подобна gun5 арабидопсиса. ФункциипродуктахлоропластногогенаMod-u-25по-видимому,состоятвблокировании механизма регуляции, направленного на предотвращениенакопленияфототоксичныхпротопорфириноввфотосинтезирующихклетках путем репрессии транскрипции генов, ферментов синтеза ХЛ.3.5.7.
Выводы1. В результате УФ-мутагенеза оранжевого светочувствительногомутанта по гену CHLH генотипа chl1, и дальнейшего многоступенчатогоотбора темно-коричневых клонов получен двойной мутант Н-19-25генотипа chl1,mod-u-25, накапливающий в 20 раз более протопорфирина IX(ПП) чем исходный мутант.2. Мутация mod-u-25, приводит к усилению активности синтеза АЛК(вдвое) на фоне мутантных аллелей генов CHLH и LTS3: chl1 и lts3, и имеетфенотипическое проявление – окраска колоний меняется от оранжевой (уодиночных мутантов) до коричневой (у двойных мутантов).
Также,мутантная аллельmod-u-25 обусловливает устойчивость несущих ееклеток к левулиновой кислоте (ЛК) в концентрации10 mM - летальной дляклеток с аллелью дикого типа.3. Мутация mod-u-25 наследуется как хлоропластный детерминант, и278является мутантной аллелью хлоропластного гена Mod-u-25.4. Хлоропластная мутация mod-u-25 не снижает чувствительностьАЛК-синтезирующих ферментов к угнетению гемом и не влияет на процесссинтеза протогема в клетках хламидомонады.
Эффект мутации выявленна уровне транскрипции генов, кодирующих белки CHLH и GTR ферментовбиосинтеза ХЛ– магний-хелатазы и АЛК-синтезирующего комплекса,соответственно.5. Фактор, кодируемый хлоропластным геном Mod-u-25 C.reinhardtiiявляется элементом регуляторной системы, препятствующей накоплениюв рвстительной клетке фототоксичных свободных порфиринов, изадействован в ретроградном контроле, - регуляции экспрессии ядерныхгенов белков фотосинтеза в ответ на сигналы хлоропласта.279ЗАКЛЮЧЕНИЕ«Наука всегда оказывается не права.Она никогда не решит вопроса,не поставив, при этом, десятка новых»Бернард ШоуПорфирины–молекулыциклических тетрапирролов, созданныеприродойдляосуществленияважнейших биологических функций(рисунок 5).
Они широко представленынаЗемлеввидехлорофиллов,обеспечивающих фотосинтез, гемов,Рисунок 5. Структура и функциипорфиринов (http://chem.iitm.ac.in)которые задействованы в транспортеэлектронов и переносе молекулярногокислорода, и корриноидов, функции которых связаны с переносомметильных групп и реакциями изомеризации. Функционально значимы итетрапирролы с открытой цепью – фикобилины (дополнительные пигментыфотосинтеза у водорослей, фитохром у высших растений), сирогем(восстановлениесульфитаинитрита),ифакторметаногенезауметанобразующих бактерий [Быховский, 1997].Синтез тетрапирролов у растений и водорослей происходит в пластидах,откуда они транспортируются к месту своей локализации: хлорофиллы (ХЛ)остаются в хлоропластах, гемы и сирогемы работают во всех клеточныхкомпартментах, а фитохромы – в цитоплазме и ядре.
Метаболизмфотосинтезирующей клетки зависит от функциональной активности всехтетрапирролов, биосинтез которых необходимо регулировать. Механизмытакой регуляции обеспечивают в первую очередь следующие процессы:утилизациюсветовойэнергии,поддержаниеоптимальногобаланса280содержания гемов и хлорофиллов, предотвращение накопления свободныхфототоксичных порфиринов, координацию биосинтезов белков и пигментов(тетрапирролы функционирует в составе пигмент-белковых комплексов). Насегодняшнийденьизвестно,чтометаболизмтетрапирроловвфотосинтезирующей клетке регулируется как на уровне транскрипции геновбелков фотосинтеза, так и посттрансляционно [Tanaka, 2008, Czarnecki andGrimm, 2012, Юрина и др., 2012].
Все известные факторы транскрипционнойрегуляции были найдены при изучении влияния света на фотоморфогенез.В контроле метаболических и сигнальных путей широко задействованмеханизм обратного ингибирования (рисунок 6А). Он реализован в цепибиосинтеза тетрапирролов для обеспечения баланса между ранними ипоздними этапами метаболического пути и предотвращения накопленияфототоксичныхрегуляторныхинтермедиатовпетель-этоХЛ.синтезОсновнаяпервоготочкаприложенияпредшественникавсехтетапирролов – 5-аминолевулиновой кислоты (АЛК), который ведут трифермента:GluTS(глутамил-тРНК-синтетаза),GluTR(глутамил-тРНК-редуктаза) и GSA-АT (глутамат-полуальдегидаминотрансфераза), последниедва из которых, физически связаны [Nogaj and Beale, 2005].
Активность АЛКсинтезирующего комплексапосттрансляционно регулируется продуктамидвух ветвей тетрапиррольного метаболизма – Fe2+– и Mg2+–содержащими:1. Гем - железосодержащий порфирин. Накапливаясь в избытке, гемподавляет синтез АЛК, напрямую ингибируя активность ферментаGluTR [Czarnecki and Grimm, 2012].2.Магниевая ветвь – протохлорофиллид (ПХЛД). Путь негативнойрегуляции синтеза АЛК протохлорофиллидом был обнаружен благодаряисследованиям мутантов Flu арабидопсиса [Lee et al., 2003]. Белок FLU вответ на избыточное накопление ПХЛД в темноте (у покрытосеменныхрастений фермент ПОР, конвертирующий ПХЛД в ХЛД активен только на281свету) связывает фермент GluTR находящийся в строме пластид, смембранами тилакоидов, тем самым прекращая синтез АЛК.Хлоропласты арабидопсиса содержат около 3000 белков, большинствоиз которых (более 95%), включая ферменты биосинтеза ХЛ, кодируютсяядернымигенами.Процессыформированияифункционированияфотосинтетических мембран зависят от координированной экспрессии геновядра и пластид в ответ на воздействия факторов внешней среды (свет,питание, температура) и внутриклеточных сигналов (активные формыкислорода, сахара, интермедиаты синтеза ХЛ и редокс-активные молекулы)[Kleineet.al.,2009].Взаимодействиеядраихлоропластовфотосинтезирующей клетки обеспечивается двойной системой генетическойрегуляции: кодируемые ядром белки и цитоплазматические факторы,поступая в хлоропласт, влияют на экспрессию генов хлоропласта, а сигналы,генерируемые хлоропластом, регулируют экспрессию генов ядра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
