Диссертация (1144823), страница 44
Текст из файла (страница 44)
Содержание пигментов в клетках анализируемыхштаммов C. reinhardtii*УсловияПигменты (нMоль/109клеток)ростаППМПЭПдХлкультурCC124wtсвет0,190,20н3280Brc-1brc-1свет0,370,67н2420Brc-8brc-1,arg7,sup-3свет0,2н2510CC124wtтемнота0,30,200,82480Brc-8brc-1,arg7,sup-3темнотанн14,52320Brc-1brc-1темнота12,300,543,412,9T8-3brc-1,arg7,sup-3,Sup-1темнота7,50,353,59,3* - в таблице даны средние значения величин, полученных в 3-6 повторностях. Во всехслучаях ошибки не превышают 5%.Обозначения (ПП – протопорфирин IX; МПЭ –магний-протопорфирин IX и егомонометиловый эфир; Пд – протохлорофиллид; Хл – хлорофиллы.н – наличие пигмента не регистрируется.ШтаммГенотип3.4.7.
Гибридологический анализ штамма Т8-3Для выяснения характера наследования мутаций, обусловливающихфенотип трансформанта Т8-3, были осуществлены скрещивания этогоштамма на исходный мутант генотипа brc-1 и штаммы дикого типа.Результаты изучения потомства этих скрещиваний методами тетрадного исемейного анализов представлены в таблице 3.35. Все 12 полных тетрадпотомства зигот скрещивания Т8-3 на штамм дикого типа СС124 в темнотедемонстрировали моногенное (2 зеленых : 2 оранжевых) наследованиемутации «оранжевости». Методом семейного анализа было установлено, что246в мейотическом потомстве 531 зиготы от скрещивания двух оранжевых втемноте культур: трансформанта Т8-3 и мутанта генотипа brc-1, всесегреганты оказались желто-оранжевыми в темноте. Отсутствие зеленыхрекомбинантов свидетельствует, что штамм Т8-3 несет в своем генотипемутацию brc-1, и гибриды (зиготы) гомозиготны по этой мутации.Таблица 3.35.
Гибридологический анализ штамма Т8-3*Родители: штамм (генотип)Семейный анализТетрадный анализ2о:2з 1о:3зmt-mt+о.з.о/зCC124 (wt)T8-300348 12Brc-3 (brc-1)(brc-1,sup-3,Sup-I)5310003о:1з оз000000210*указано количество выросших в темноте колоний фенотипа: о – оранжевые, з – зеленые,о/з – секторные колонииИзучение комплементации мутантных аллелей, обусловливающихоранжевый фенотип (таблица 3.36), показало, что зеленые в темнотедиплоиды формировались только при объединении в составе гибрида геномаштамма Т8-3 и штаммов, несущих аллель дикого типа гена LTS3: СС124 иСС38.
Поскольку мутантные аллели brc-1и lts3 рецессивны по отношению каллелю дикого типа, такие результаты означают, что в штамм Т8-3 несетмутантную аллель brc-1 гена LTS3. В случаях, когда трансформантскрещивали с мутантами по гену LTS3: Brc-1 и 62-2e, диплоиды имелимутантный фенотип, и, при этом, не росли на свету, как и штамм Т8-3.Светочувствительность таких гибридов свидетельствует о доминантномхарактере проявления инсерционной мутации.МутантныеаллелигенаLTS3некомплементируютсаллелем,обусловливающим оранжевую окраску культур трансформанта Т8-3. Нарядус отсутствием рекомбинации, эти данные свидетельствуют, что трансформантТ8-3 является обратным мутантом по гену LTS3 (то есть несет исходнуюмутантную аллель brc-1).
У штамма Т8-3 в результате инсерции оказался247Таблица 3.36. Штамм Т8-3. Комплементация инсерционной аллелиШтаммы, использованные для создания диплоидовmt (+)mt (-)Штамм,Штамм Генотип ФенотипфенотиптемнотасветФенотип диплоидовТемнота,Свет,Среда TAP среда ТT-8-3CC124wtзеленыйоранжевый вBrc-1brc-1оранжевыйтемноте, неCC38ac14зеленыйзеленеет насвету*- ас- культуры не растут на среде Т (без ацетата).зеленыйзеленыйзеленыйзеленый, ac*оранжевый зеленыйзеленыйзеленыйвыключенным ген, продукт которого, по-видимому, необходим для процессазеленения – светоиндуцированного синтеза хлорофилла. На фоне гомозиготыпомутациямвгенеLTS3проявлениеинсерционнойаллели,обусловливающей потерю способность к зеленению мутантов по гену LTS3,носит доминантный характер, - признак сохранялся у диплоидов, в геномекоторых эта аллель находилась в гетерозиготном состоянии.
В случаегетерозиготности по мутации в гене LTS3, проявление инсерционной мутацииносит рецессивный характер – диплоиды, гетерозиготные по инсерции, такжекак и по мутации ацетатзависимости ac-14, способны расти на светуфотоавтотрофно - без ацетата. Вероятно, характер проявления инсерционноймутации (доминантный или рецессивный) зависит от контекста - наличие вклетке нормально функционирующего продукта гена LTS3 – факторатранскрипции меняет характер взаимодействия аллелей гена-мишени.
Повидимому, продукт гена, нарушенного вставкой (названный SUP-1),функционально активен только при наличии нормального белка LTS3.Таким образом, установленное в ходе гибридологического анализаотсутствие комплементации и рекомбинации между мутацией brc-1 имутацией, обусловливающей оранжевую в темноте окраску клонов штаммаТ8-3, свидетельствуют, что геномы обоих штаммов Brc-1 и T8-3 содержатодну и ту же мутантную аллель гена LTS3 – brc-1. Сходство пигментного248состава клеток этих штаммов служат тому подтверждением.
По-видимому, утрансформанта Т8-3 инсерцией был разрушен либо ген SUP-3, продукткоторого супрессирует мутации в гене LTS3, либо другой ген, продукткоторого действует на более ранней, чем SUP-3, стадии активации зеленения.Неспособность трансформанта зеленеть на свету позволяла предполагать, чтоэтот регуляторный фактор SUP-1 участвует в передаче светового сигнала инеобходим для адаптации клеток хламидомонады к фотоавтотрофнымусловиям существования. Доминантное проявление мутантной аллели Sup-1на фоне гомозиготы по мутациям в гене LTS3, свидетельствует, что оба белка– LTS3 и SUP-1 взаимодействуют, и белок LTS3 необходим для реализациифункции фактора SUP-I.
Для молекулярной идентификации этого фактора,осуществили локализацию инсерции в ядерном геноме C. reinhardtii.3.4.8. Поиски гена SUP-1 в геноме трансформанта Т8-3В поисках гена SUP-I в геноме C. reinhardtii осуществлена локализацияинсерции ˗ найдено место вставки плазмидной ДНК в геном трансформантаТ8-3.Нуклеотидныепоследовательности,фланкирующиеинсерцию,идентифицировали методом LMS-PCR (Ligation-mediated suppression-PCR)(рисунок 3.34А), предложенным Олафом Крузом c соавторами [Strauss et al.,2001]. В результате экспериментов был получен фрагмент ДНК размеромоколо 250 пн (рисунок 3.34Б), который в дальнейшем был клонирован ввектор pGEM-T (Promega, USA) и секвенирован.расшифрованГеномхламидомонады(http://genome.jgi-psf.org/Chlre4/Chlre4.home),иучастокядерной ДНК, соответствующий фланкирующей инсерцию нуклеотиднойпоследовательности АР, был обнаружен по гомологии (программа BLASTN2.2.21).
Клонированный фрагмент AP оказалась участком хромосомы 13, аинсерция в геноме штамма Т8-3 была встроена в хромосому 13 междунуклеотидами, занимающими положение: 1,194740 и 1,194741.249БАРисунок 3.34. Получение фрагмента АР, фланкирующего инсерцию.А - Схема, иллюстрирующия метод LMS-PCR (по: Strauss et al., 2001).Амплификация фрагмента ДНК, не содержащего локус-специфичный сиквенс,супрессирована за счет образования структур-сковородок (panhandle) с ручками,формируемыми адапторами. Б - Геномная ДНК штамма Т8-3 порезанарестриктазой PvuII, лигирована с адапторами(5‘-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3‘; 3‘-H2N-CCCGTCCA-P-5‘);ииспользована для ПЦР-амплификации с праймерами, один из которыхспецифичен к плазмидной ДНК (pARG7-8 - 5‘-AGTCAGGCACCGTGTATGAAATCT-3)‘;а другой – к адапторам (AP1 - 5‘GGATCCCTAATACGACTCACTATAGGG-3‘,AP2 - 5‘-A ATA GGG CTC GAG CGG CПосле локализации инсерции, требовалось найти мРНК, транскрипциякоторых была нарушена вставкой.
Среди имеющихся в Базе данныхгеномного проекта более 16000 транскриптов удалось обнаружить толькоодну мРНК, которая транскрибировалась с ОРС, нарушенной инсерцией.Транскрипт(jgi|Chlre4|514336|au5.g4469_t1)принадлежитгену,локализованному на хромосоме 13 (в положении: 1,193966-1,195740), и егоструктурабылавоссоздананаосновесравнениянуклеотидныхпоследовательностей геномной ДНК и транскриптов, а также с помощьюпрограммыGreenGenie,позволяющеймоделироватьструктуругена(http://bifrost.wustl.edu/GreenGenie2). Ген размером 1775 пн включает дваинтрона – 236 пн и 605 пн, первый из которых расположен в 5‘некодирующей области (рисунок 3.35а).
Транскрипт размером 933 пн,250содержит 327 нуклеотидов ОРС и кодирует белок из 108 аминокислотныхостатков.Виртуальный белок, кодируемый геном SUP-1, в базе данных геномногопроекта хламидомонады обозначен как ID 514329 (рисунок 3.35б). Онсодержит 108 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 11,436kDа.Дляпредсказанияегоструктурыисвойств,аминокислотнаяпоследовательность белка была проанализирована с помощью программногообеспечения,доступногона(http://www.expasy.ch/cgi-bin/protparam)сайтахиNCBI,PBILExPASY-tool(http://pbil.univ-lyon1.fr/).Такая «прогонка» не дала однозначных ответов на вопрос о возможныхфункцияхSUP-1.Суммируяполученныйданные,можносчитатьустановленным, что в структуре белка много (56%) альфа спиралей(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopm.pl),инеттрансмембранныхрайонов (http://topcons.cbr.su.se). В его последовательности не найденохлоропластных (http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP) и митохондриальных(http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot) транзитных последовательностей, и имеетсясайт фосфориллирования (в позиции 92) протеинкиназой С (PKC)(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhosK).Рисунок 3.35.
Структура гена SUP-1 C. reinhardtii - (а), и кодируемый им белок- (б). Стрелка - место инсерции в геноме штамма T8-3. Прямоугольники - экзоны,линия - интроны. Цифры указывают размеры (пн) экзонов (вверху) и интронов(снизу). Рамкой обведен сайт фосфориллирования РКС.251ВышепотечениюотначалагенаSUP-I,нуклеотиднаяпоследовательность ДНК содержит несколько GATA–элементов (рисунок3.36), свидетельствующих о возможной регуляции транскрипции этого генафакторами транскрипции семейства GATA. Отсутствие G-боксов (CACGTG)и CRE-элементов (TGACGTCT) позволяет предполагать, что транскрипциягена не регулируется светом и источниками азота и углерода.>Chlre4chromosome_13:1192971-11939905'pad=03'pad=0strand=+1,192,971TGCGTGCCCCGGTCAGCGACGCTGCGCAAGTGGTGAGGCTCACGCACTAGGAGCCCCCAT1,193,0301,193,031GAGCCAGACTACTAGTCTAGCACTCCTTGCGTGCGACAGCTGCTGTTGCCGCTGCGCCAA1,193,0901,193,091AGGCTCGCGTTGGCTGTTGGCGAGGACTGGAAGCTTTCTCCTTAGGCTAAGTGGGGCACG1,193,1501,193,151GCCCGGACTGTGCTTGGGTCACTAGAATGAGCTCAAAGGATTCAAGTGGGCCCAGCTTGG1,193,2101,193,211ACACCAGCTGCGGTCGCGACGGAGCTCTGGCCCAGCGACCGTGATAACTCTCAGGTACCG1,193,2701,193,271AGTATTCGCAGTCAGGTCTATGCTATTCATAATACCAAAGTGTCCCATCCATGGCTGTGA1,193,3301,193,331GCCGGCAAGTTGGTCAAGGCGCTGCGAAGCTCCGGCCGCAGATGGGCTGTCCCTGAGACC1,193,3901,193,391CTGACGATAGACGACCAGCTCAGGGAAGCTCTGTGGCGCGCCAGCACATAATAACAGCAA1,193,4501,193,451CAATAAAAGCGCACGCGGATTTTGCGCCCACAGCCTGGTCGTGCCAGCTCGTGAAAGACA1,193,5101,193,511GCGCTGGTCTTGTCGTCCGTTTTTCGGGCCAGCCTTCCTGTGCAACCCAGCTGGGCTTTG1,193,5701,193,571CGCAACCAGTGCAACTGCAAATGTTTTGACTGATATGCACATTGCATTCGCGTTGTGCGC1,193,6301,193,631TTAGGCTGCTTAAATGCCGCTGCTCTGTCCGTGCCCCGGTGCACAACCCGGCCCCTGCTT1,193,6901,193,691ACCAGTCTTAGCCCATGTTACCATATGTGTTTAAGGACAGCCGTGGCGGGCATGGTGGAG1,193,7501,193,751TTGGCAGGGTGGCACAGGTTGGATCGGTGGGGCAAAGGTGGGGTCGGTAAAAGTCGGTGG1,193,8101,193,811GGATGACACGGCCAGATTCATGCCAACTTATCCTGGTCGCGCAGTCTAAACAGTGATACC1,193,8701,193,871CATTCTCAACAGTAGTGACCAAACTTGCTTGCCGAGTCAGAACTTGAAAGAACTGACAAA1,193,9301,193,931GTGTCCGCACGGACATATATAATTTGCATTACGTACTAATCTCGCAGCTATAGCAAGTTG1,193,990Рисунок 3.36.
ДНК 5‘-фланкирующего района выше по течению от точки началатранскрипции гена SUP-I (в соответствии с версией 4 геномного проекта - Сhlre4).Подчеркиванием отмечены первые нуклеотиды гена. Мотивы GATA и TATC(вторая цепь) – помечены скобками.При поиске белков, гомологичных SUP-I (программы BLASTP) восновных базах данных ( nr, uniprot) удалось обнаружить только один егоортолог – предсказанный белок (D8TRZ4, EMBL GL378334) вольвокса Volvoxcarteri размером 100 аминокислотных остатков (11,49 kD) с высокойстепеньюсходстванемногочисленные–(вболееосновном,50%идентичности.предсказанные)Всеостальныепоследовательности,найденные с помощью различных вариаций программы BLAST, имели менее20% сходства с анализируемым белком. Среди них оказались белки-триггеры252бактерии Legionella и регуляторы транскрипции AMY-1 – маленькие белки(массой 11 kDа,) – активаторы транскрипции протоонкогена - c-Myc,играющего ключевую роль в пролиферации клеток и апоптозе.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
