Диссертация (1144823), страница 46
Текст из файла (страница 46)
Результаты измерения активности магний-хелатазыв клетках T8-3 свидетельствуют, что в условиях in vitro ферментвысокоактивен, но живые клетки in vivo не способны синтезировать ХЛ.Такой эффект можно ожидать в случае, если белок, кодируемый геном SUP-I,регулирует МХ на посттрансляционном уровне и для еѐ активностинеобходима целостность хлоропластных мембран. Подобный эффект описандля белка GUN4 арабидопсиса, который взаимодействует с ПП и Mg-ПП –субстратом и продуктом МХ. Он активирует этот фермент, связывая его стилакоидными мембранами хлоропласта, и участвует в передаче сигналов изхлоропласта в ядро [Larkin et al., 2003].
Его ортолог - ген GUN4 C. reinhardtii,локализован в хромосоме 6 и кодирует белок размером 260 аминокислотныхостатков [Formighieri et al., 2012]. Обнаруженный нами ген SUP-I по своейлокализации в хромосоме 13 и структуре не соответствует GUN4, и, повидимому, является еще одним компонентом регуляторной системы,обеспечивающей функционирование комплекса МХ в клетках C. reinhardtii.Для ответа на вопрос, влияет ли белок SUP-I на транскрипцию генаLTS3, был проведен сравнительный анализ экспрессии этого гена утрансформанта Т8-3.
В норме ген LTS3 негативно регулируется светом впервые несколько часов экспозиции темновых культур, и позитивно –ацетатом, свидетельствуя о том, что функционирование его продуктанеобходимо клеткам C. reinhardtii в гетеротрофных условиях роста.Выключение гена SUP-I у штамма Т8-3 ведет к резкому снижению уровняLTS3-транскриптов (рисунок 3.37). Такой фенотип свидетельствует, чтобелок SUP-I, отсутствующий у трансформанта, по-видимому, вместе сфактором LTS3 входит в состав регуляторной системы, контролирующейработу МХ в темноте. Продукт гена SUP-3, в норме подавляет иной путьактивации этого фермента у хламидомонады.2593.4.12. Выводы1. От мутанта хламидомонады Brc-1 по гену LTS3, клетки которого втемноте накапливают протопорфирины и формируют оранжевые колонии,получен зеленый спонтанный ревертант Brc-8.
Восстановление темновогобиосинтеза хлорофилла у ревертанта обусловлено рецессивной ядерноймутацией в гене SUP-3, сцепленном с геном LTS3. Супрессорный эффектмутации не аллелоспецифичен.2. Ген SUP-3 кодирует фактор негативной регуляции активностимагний-хелатазы, - эффект мутации sup-3 состоит в усилении активностиэтого фермента.3. В результате инсерционного мутагенеза ревертанта Brc-8генотипа:brc-1,sup3 получен обратный мутант Т8-3, фенотип которого втемноте соответствовал фенотипу исходного мутанта Brc-1 по гену LTS3,но штамм Т8-3 утратил способность зеленеть на свету. Гибридологическийанализ показал, что геномы обоих штаммов Brc-8 и T8-3 содержат одну иту же мутантную аллель гена LTS3 – brc-1, что подтверждвется исходством пигментного состава их клеток.4.
В геноме штамма Т8-3 инсерция картирована в хромосоме 13, иустановлено, что разрушенный вставкой ген SUP-I размером 1775 пн,содержит два интрона– 236 пн и 605 пн. Его транскрипт размером 933 пн,включает 327 нуклеотидов ОРС и кодирует белок из 108 аминокислотныхостатков. Промоторная область гена SUP-I содержит несколько GATA–элементов, свидетельствуя о возможной регуляции экспрессии этого генафактором транскрипции семейства GATA - LTS3. Отсутствие G-боксов(CACGTG) и CRE-элементов (TGACGTCT) позволяет предполагать, чтотранскрипция гена не регулируется светом и источниками азота и углерода.5. Ядерный белок, кодируемый геном SUP-1, участвует в поддержаниивысокого уровня транскрипции гена LTS3 в темноте.2603.5.
Изучение генетической регуляции биосинтеза хлорофилла намодели мутантов C. reinhardtii по гену CHLHМутации chl1 и brs-1 в ядерном гене CHLH большой субъединицымагний-хелатазы (МХ), блокируют работу этого фермента, приводя кнакоплению небольших количеств его субстрата - протопорфирина IX(ПП) [Чекунова и Квитко, 1986; Chekounova et al., 2001]. Неспособность ксинтезу значительных количеств ПП обусловлена механизмами регуляциибиосинтеза хлорофилла (ХЛ), которые предотвращают накопление вклетках зеленых водорослей и высших растений свободных фотоактивныхпорфириновпутемретроингибированияилирепрессиипервогоинтермедиата ХЛ 5-аминолевулиновой кислоты (АЛК) гемом или ПХЛД.Для поиска новых регуляторных механизмов, контролирующих уровеньсодержания фототоксичных интермедиатов ХЛ у хламидомонады,исследованы мутанты с нарушениями такой регуляции.
Они были полученына основе оранжевых в темноте, не имеющих ПХЛД мутантов по генуCHLH как двойные мутанты, клетки которых накапливают ПП вколичестве, сравнимом с уровнем содержания ХЛ у штаммов дикого типа,и формируют тѐмно-коричневые клоны. В результате их генетикобиохимических исследований найдена новая хлоропластная мутация mod-u25, которая приводит к сверхпродукции по ПП в клетках двойныхмутантов C.reinhardtii генотипа: chl1,mod-u-25 за счет усиления синтезаАЛК [Чекунова и др., 1993].
Отсутствие в клетках коричневых мутантовхарактерной для chl1-мутантов темновой репрессии транскрипции генов:CHLH, GTR и CABII, кодирующих белки МХ, АЛК-синтезирующегокомплекса и светособирающего комплекса ФС2 свидетельствует, чтопродукт гена Mod-u-25 задействован в регуляции пути передачи сигналов изхлоропласта в ядро.2613.5.1. Получение и описание коричневых мутантов хламидомонадыПосле обработки УФ-лучами (254 нм) мутантов по гену CHLH C.reinhardtii и последующего многоступенчатого отбора, направленного населекцию наиболее темно-окрашенных коричневых клонов, были полученыштаммы, клетки которых содержали в условиях гетеротрофного роста болеечем в 20 раз больше протопорфирина IX (ПП), чем одиночный мутант chl1(таблица 3.37).
Из этой группы для дальнейших исследований выбралиштамм H-19-25, способный накапливать максимальное количество ПП(рисунок 3.39). Для выяснения генетической природы мутации, приведшейк избыточному накоплению ПП - фототоксичного интермедиата биосинтезаХЛ, был осуществлен его гибридологический анализ.Рисунок 3.39. Культуры исследуемых мутантов, растущие гетеротрофноТаблица 3.37. Продуктивность по протопорфирину IX (ПП)коричневых мутантов хламидомонадыШифрштаммаГенотип исходногоштаммаДоза УФ-лучей(дж/м2)Продуктивность поПП (μмоль/109кл)1515-19вН-19-4Н-19-5Н-19-10Н-19-251514-7вК-1514-7вchl1-19,mt - // - // - // mtchl1,mt+- // -020255025002500,194±0,0933,142±0,01233,215±0,01073,543±0,01454,593±0,03210,177±0,00413,940±0,00682623.5.2.
Гибридологический анализ коричневых мутантовНаследование мутации, определяющей высокий уровень синтеза ПП умутантов по гену CHLH, изучали методом гибридологического анализа –исследуя потомство зигот, сформированных при скрещивании коричневыхмутантов со штаммами дикого типа и исходными мутантами генотипа chl1(таблицы: 3.38, 3.39). В тетрадном анализе потомства скрещиваниякоричневого мутанта Н-19-25 (mt-) на штамм дикого типа (С1525) только 2из 42 полных тетрад содержали коричневые клоны (табл. 3.38). Сегрегантыбольшинства тетрад (30 из 42) демонстрировали отсутствие коричневойокраски и менделевское расщепление по мутации chl1 (2 ор.
: 2 зел.).Напротив, в составе большинства тетрад (20 из 24) реципрокногоскрещивания (С1712) появлялись коричневые колонии. Исчезновение впотомстве признака, который нес родитель типа спаривания mt(-), ипреимущественная его передача от родителя mt(+) давали основаниепредположить внеядерную – хлоропластную локализацию изучаемоймутации, получившей название mod-u-25. Характер ее наследованияпроверяли и методом семейного анализа, когда мейотическое потомствозиготы формирует одну колонию (табл. 3.39).
Этот метод был использованпри учете расщепления в потомстве скрещиваний коричневого мутанта сисходными мутантами по гену CHLH, поскольку низкая выживаемостьзигот (0,6 % – 1.1%) не позволяла применить тетрадный анализ. ШтаммН-19-25 mt(-) передает по наследству маркер mod-u-25 с низкой частотой –исключительные зиготы (зиготы, в которых цитоплазматические маркерыпередаются от родителей обоих типов спаривания) составляют 0,46% 0,56% (таблица 3.38).
В случае реципрокного скрещивания (С1531) мутацияmod-u-25 передается потомству в 86% зигот. Тетрады, в которых все 4потомкаформировализеленыеколонии,оказалисьмитотическимпотомством вегетативных диплоидов - средний объем их клеток (около 208263мкм)и единообразие по типу спаривания - все mt(-) соответствоваликритериям диплоидности клеток хламидомонады [Harris, 1989].Таблица 3.38. Тетрадный анализ мейотического потомства зиготскрещиваний коричневых мутантов хламидомонады на штаммыдикого типаНомерскрещиванияГенотипыродителейmt(+)mt(-)1525wt1712chl1,mod-u-25chl1,mod-u-25wt2 зел: 2 ор30Число полных тетрад срасщеплением:2 зел : 4 зел 2 зел :1 ор2 кор: 1 кор.210012040∑Передачапризнакаот mt(+)424,75%2596%Генотипы родителейmt(+)mt(-)152534wt15270,6chl115311,1chl1,mod-u-25chl1, mod-u25chl1, mod-u25chl1ор.Число колоний:кор.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
