Диссертация (1144823), страница 50
Текст из файла (страница 50)
Длявыяснения природы этих сигнальных молекул наиболее эффективнымоказался генетический подход. Регуляторный белок GUN4 был обнаруженпри поиске мутантов арабидопсиса с нарушенной регуляцией синтеза ХЛ, –способныхсохранятьвысокийуровеньтранскрипциихлорофилл-связывающих СAB-белков при деструкции хлоропластов [Susek et al., 1993].Наличие этого белка необходимо для активации магний-хелатазы (МХ) иАЛК-синтезирующего комплекса [Larkin et al., 2003;Adhikari et al., 2011].
Вядерном геноме C. reinhardtii обнаружено два гена, кодирующих GUN4подобные белки, и показано, что продукты этих генов посттрансляционнорегулируют передачу ретроградных сигналов (из хлоропласта в ядро)[Brzezowski et al., 2014]. GUN4 взаимодействует с субъединицей H МХ исвязывает ее с тилакоидными мембранами, тем самым, активируяфермент. Почему при этом усиливается работа АЛК-синтезирующихферментов? –временидо сих пор неизвестно. Как неизвестными до последнегооставалисьмеханизмырегуляциибиосинтезаПХЛДиз282пропопорфирина IX.Приступая к работе по идентификации и клонированию новых геновзеленой водоросли хламидомонады, вовлеченных в светонезависимый синтезхлорофиллов, мы намеревались понять, – каким образом осуществляетсягенетический контроль биосинтеза ХЛ, и какую роль эти гены играют врегуляциипроцессовхлорофиллобразованияифункционированияфотосинтезирующей клетки?Представленная работа посвящена исследованиям малоизученныхмеханизмов контроля ранних этапов биосинтеза ХЛ (до формированиямолекулПХЛД)умодельногообъектагенетикифотосинтеза–одноклеточной зеленой водоросли C.
reinhardtii методами генетики,молекулярнойбиологииигеномики.Предметисследований–бесхлорофилльные мутанты, накапливающие протопорфирин IX (ПП), субстрат фермента МХ, их ревертанты и обратные мутанты.Фенотип бесхлорофилльных, накапливающих ПП в темноте, мутантовC. reinhardtii, оказался обусловлен мутациями в двух ядерных, несцепленныхмежду собой генах – CHL1 и LTS3.
Штаммы, мутантные по гену CHL1, былисветочувствительны (гибли на свету), а мутанты по гену LTS3 сохранялиспособность зеленеть при освещении. В терминах формальной генетики, генCHL1 мог быть отнесен к структурным генам, а LTS3 – к регуляторным. Всеисследуемые мутации приводят к подавлениию активности фермента МХ,встраивающего магний в молекулы ПП в цепи биосинтеза ХЛ.Молекулярно-генетические исследования мутантов первой группы(оранжевых, светочувствительных), позволили установить, что ген CHL1,переименованный позднее в CHLH, кодирует большую субъединицу МХ.Осуществленоегоклонирование-полученаполнаянуклеотиднаяпоследовательность этого гена (7035 пн), и определена его интрон-экзоннаяструктура - ген CHLH содержит 12 экзонов и 11 интронов.
Его кДНКразмером 5049 пн содержит ОРС длиной 4186 пн, кодирующую 1399283аминокислотных остатков, и длинный (827 пн) 3‘-нетранслируемый конец.По данным секвенирования мутации chl1 и brs-1 являются вставками (+1) вэкзонах 9 и 10 гена CHLH, соответственно. Они вызывают сдвиг рамоксчитывания и, в результате трансляции мутантных мРНК, появляютсякороткие нефункциональные пептиды длиной 457 и 559 аминокислотныхостатков, соответственно. Ген CHLH уникален – в геноме C.
reinhardtii необнаружено его паралогов. Он кодирует хлоропластный, слабо связанный смембранами белок с молекулярной массой 154,29 kDа. По даннымфилогенетического аналиаза, общим предшественником для всех известныху про- и эукариот ортологов белка CHLH является CobN – кобальт-хелатазапрокариот.
Экспрессия гена CHLH в клетках хламидомонады позитивнорегулируется светом на уровне транскрипции, и мутации chl1 и brs-1 в генеCHLH не оказывают заметного влияния на эту регуляцию.Все особенности фенотипа мутантов хламидомонады по гену LTS3,свидетельствовали, что продукт этого гена регулирует транскрипцию генов,кодирующих фермент МХ в темноте:a) lts3-мутанты в темноте накапливают субстрат МХ - ПП и следовыеколичества его магниевых производных (Mg-ПП Mg-ППМЭ и ПХЛД),На свету –они зеленеют.
Процесс зеленения запускается во вновьобразованных в условиях освещения клетках;b) активность МХ у lts3-мутантов подавлена в темноте (она составляет22% от уровня таковой в световых культурах дикого типа). На светуонавосстанавливается.ОтносительнаяактивностьАЛК-синтезирующего комплекса мутантов в отсутствие света такжередуцирована и составляет 4-7% от нормы;c) транскрипция генов, кодирующих МХ и фермента GSA-AT, входящегов состав АЛК-синтезирующего комплекса, снижена в темноте.
На светуона восстанавливается с временной задержкой. Cинтез белков большой(H) и малой (I) субъединиц МХ у штамма дикого типа и мутанта lts3284соответствует динамике накопления мРНК этих генов, означая, что ихэкспрессия регулируется на уровне транскрипции.Осуществлено картирование и позиционное клонирование гена LTS3. Онлокализован в ядерной группе сцепления (хромосоме) I C. reinhardtii нарасстоянии 29 сМ от своей центромеры. В соответствии с версией 4геномного сиквенса C.
reinhardtii,ген LTS3 занимает положение: 36970973698067 пн на хромосоме I (http://genome.jgi-psf.org/Chlre4/ ). Ген содержит 2экзона (58 пн и 257 пн) и 1 интрон (156 пн). Его транскрипт, размером 815пн включает короткий (33 пн) 5‘-нетранслируемый район (5‘UTR), открытуюрамку считывания ОРС (315 пн), и длинный (467 пн) 3‘нетранслируемыйконец (3‘UTR).
Белок, кодируемый геном LTS3, по-видимому, состоит из 104аминокислотных остатков (ак) и имеет молекулярную массу 11,067 kDa.МетодамибиоинформатикивегосоставеобнаруженодинДНК-связывающий домен со структурой «цинкового пальца», типичный длятранскрипционных факторов семейства GATA (ZnF_GATA).Секвенированиемутантных аллелей brc-1 и lts3 гена LTS3 показало, что они несут мутации,приводящие к сдвигу рамки считывания и синтезу белков, не содержащихGATA-домен. По-видимому, функциональная активность LTS3 определяетсяего доменной структурой, и он является регулятором транскрипции.Транскрипция гена LTS3 в норме негативно регулируется светом ипозитивно – источником углерода ацетатом, свидетельствуя, что продуктэтого гена необходим клетке в условиях гетеротрофного роста.
В результатепоиска белков, гомологичных LTS3, в базах данных nr (BLAST) удалосьустановить, что ортологи белка LTS3 (219 белков), имеются только уэукариот. Их гомология основана на сходстве цинк-пальцевых ДНКсвязывающих доменов GATA типа и позволяет отнести изучаемый белок ксемейству факторов транскрипции ZnF_GATA. В геноме хламидомонадыобнаружено 3 паралога LTS3, выяснение функций которых еще предстоит.285Анализ 5‘-фланкирующих районов генов C. reinhardtii, кодирующихферменты биосинтеза ХЛ, показал, что они содержат GATA-элементы сайты связывания с ZnF_GATA факторами (от одного – у ALAD и CHL1, допяти – у GSA).
G-боксы (CACGTG) – последовательности, существенные длясветовой регуляции транскрипции, найдены у трех из 7 анализируемыхгенов: GSA, CHLH и CHLD. Наличие сайтов связывания с факторамитранскрипции семейства Zn_F GATA в промоторных областях генов,кодирующих ферменты синтеза АЛК и МХ, подтверждает гипотезу об ихрегуляциифакторомLTS3.Вцелом,результатыисследованийсвидетельствуют, что новый ядерный регуляторный ген хламидомонадыLTS3 кодирует фактор транскрипции семейства GATA. Его функциисостоят в активации экспрессию генов ключевых ферментов синтеза ХЛ МХ и АЛК-синтезирующего комплекса (ген GSA фермента GSA-AT) вгетеротрофных условиях выращивания, и он, также, необходим для раннихэтапов световой регуляции этих генов (рисунок 6Б).От бесхлорофильных, накапливающих ПП в темноте, мутантовхламидомонады по гену LTS3, был получен ревертант Brc-8 генотипа brc-1,sup-3. Восстановление темнового биосинтеза ХЛ у него произошло врезультате активации фермента магний-хелатазы, подавленного у мутантов.Молекулярно-генетические исследования супрессии мутаций в гене LTS3позволили найти два новых ядерных гена хламидомонады SUP3 и SUP-1.
Вотсутствие нормально-функционирующего регулятора транскрипции LTS3,фактор SUP3 контролирует дополнительный путь активации магнийхелатазы в темноте, который может быть индуцибельным и связан сметаболизмом азота и углерода в клетке водоросли. Ядерный ген SUP-Iразмером 1775 пн локализован в хромосоме 13 хламидомонады. Он содержитдва интрона – 236 пн и 605 пн. Его транскрипт размером 933 пн, включает327 нуклеотидов ОРС и кодирует белок, содержащий 108 аминокислотныхостатков. Промоторная область гена SUP-I содержит несколько GATA–286элементов, свидетельствующих о возможной регуляции транскрипции этогогена фактором LTS3. Виртуальный белок SUP-I функционирует в ядре (он неимееттрансмембранныхмитохондриальныхрайонов,транзитныха,также,хлоропластныхпоследовательностей)иучаствуетивподдержании высокого уровня транскрипции гена LTS3 в темноте, то естьявляется активатором его транскрипции.
Наличие сайта фосфориллированияпротеинкиназой С (PKC) в его последовательности указывает, что SUP-Iпредставляет собой важный элемент системы транскрипционной регуляцииядерныхгенов,контролирующихпроцессытемновогобиосинтезахлорофилла у хламидомонады. Взаимодействие генов LTS3 и SUP-I былоустановленовкомплементационномтесте.Оказалось,чтоэффектпроявления инсерционной мутации (доминантный или рецессивный) зависелот контекста – наличие в клетке нормально функционирующего продуктагенаLTS3менялхарактервзаимодействияаллелейгена-мишени.Доминантный эффект мутантной аллели Sup-I на фоне гомозиготы помутациям в гене LTS3, свидетельствует, что оба белка – LTS3 и SUP-Iвзаимодействуют, и фактор транскрипции LTS3 необходим для реализациифункции фактора SUP-I.
По-видимому, они оба в составе регуляторнойсистемы, контролируют работу МХ в темноте через активацию транскрипциикодирующих еѐ генов. Продукт гена SUP-3, в норме подавляет иной путьактивации активности МХ у хламидомонады.Таким образом, помимо протохлорофиллид-оксидоредуктазы (ПОР), уC. reinhardtii первый специфический фермент биосинтеза ХЛ – магнийхелатаза является важнейшим компонентом системы регуляции процессовего формирования в гетеротрофных условиях роста. Нам удалосьобнаружить два пути активации МХ в темноте.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
